水稻新型胞质不育系L-orfH79和L-orf290的构建及遗传分析

• 作 者: 田泽
• 机 构: 中南民族大学
• 出 处: 中南民族大学
• 发表日期: 2018年12期
• 关键词: 水稻

以2个细胞质不育相关基因orfH79和orf290特异分子标记辅助选择，从102份AA基因组的野生稻和824个栽培稻品系中筛选并构建了与YTA同核异质的新型胞质纯合不育系L-orfH79和初步纯合的不育系L-orf290材料。以3个与YTA同核同质的近等基因恢复系L-Rf5、L-Rf6、L-Rf5-6对2个新型胞质不育系恢复的遗传效应的进行了初步分析，取得以下结果：
　　1. Southern Blot对13个L-orf290（BC4F1）候选材料进行分析，证实13个材料只含orf290，不含有orfH79；在13个L-orf290候选材料中，以YTB为轮回父本的回交 BC4F1与 BC3F1的花粉育性、套袋结实率和自然结实率相比， L-orf290候选材料z597和z604育性降低明显，其它材料育性变化不明显。以Rf5和Rf6相关的特异分子标记对13个候选材料进行鉴定，未发现含有恢复基因Rf5和Rf6，但有rf5和rf6，证实13个L-orf290候选材料的BC4F1育性高低可能与Rf5和Rf6没有相关性。在13个L-orf290候选材料的BC4F1中，orf290的表达量均较 YTA低，且Ⅷ期幼穗和同时期剑叶中的表达量无显著差异。克隆13个L-orf290候选材料（BC4F1）的orf290，序列比对分析结果显示除其下游区有T-A和A-T两个碱基变化外，在ORF区与不育系YTA没有差异，但转录后是否存在基因编辑，尚需进一步证实。
　　2.以新型胞质不育系L-orfH79为母本，分别与L-Rf5、L-Rf6以及L-Rf5-6进行杂交，后代进行套袋自交至F4代，以rf5、Rf5、rf6和Rf6基因特异的分子标记对近等基因恢复系和 L-orfH79/L-Rf杂种 F4代植株进行鉴定表明，与 YTA同核同质的近等基因恢复系 L-Rf5、L-Rf6和 L-Rf5-6没有 rf5和 rf6，而L-orfH79/NIL-Rf的 F4代大多数植株也不含含有 rf5和 rf6。对近等恢复系和L-orfH79/NIL-Rf的F4代植株的花粉育性、套袋结实率和orfH79转录本表达量的统计分析表明，不育系L-orfH79导入恢复基因后，orfH79 mRNA的表达量降低，育性得到恢复且稳定遗传。
　　3.利用 CRISPR/Cas9系统的特异性及定位编辑的特性对近等基因恢复系L-Rf5和L-Rf6中的Rf5和Rf6进行基因编辑。根据水稻Rf5和Rf6的序列，针对Rf5和 Rf6外显子区域设计3对合适靶标位点的目的序列，构建了pC1300-Cas9-Rf5A、pC1300-Cas9-Rf5B和pC1300-Cas9-Rf6载体，通过农杆菌介导转化近等基因恢复系L-Rf5和L-Rf6。对3种转基因植株的编辑率的统计表明， T0-Cas9-L-Rf6转基因植株的编辑率为79.17％，T0-Cas9-L-Rf5B转基因植株的编辑率为84.58％， T0-Cas9-L-Rf5A转基因苗小，其编辑率尚待以后统计。对T0-Cas9-L-Rf6和T0-Cas9-L-Rf5B花粉育性的初步观察表明，T0-Cas9-L-Rf6的植株的花粉育性明显降低，但结实率仍较高；T0-Cas9-L-Rf5B的植株的花粉育性和结实率均降低，但对近等基因恢复系L-Rf5和L-Rf6中Rf5和Rf6基因编辑的效应，尚需对其后代的花粉育性和结实率进一步观察统计验证。