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随着生物分析技术的不断发展与进步，生物医学分析对各类靶标物的检测与分析技术提出了更高的要求。然而，传统的检测方法，如以荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）为代表的荧光分析方法，存在生物自荧光干扰、光漂白、光毒性、供体共激发等弊端，在很大程度上影响了检测方法的灵敏度和分析的特异性。因此，建立针对靶标物进行高灵敏度、高特异性、便捷、低成本和更具通用性的检测方法，已经成为生物医学分析领域的迫切需求。在本文中，我们通过利用能与DNA进行特异性识别的蛋白质结构原件设计了一系列可与核酸检测体系相兼容的生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer，BRET）体系，具体包括以下四个方面内容：
1.以DNA为模板的BRET信号模块的构建
通过将锌指结构域 Zif-268和 AZP-4分别与能量供体萤光素酶 Nluc（NanoLuciferase，Nluc）和受体黄绿色荧光蛋白（mNeonGreen）进行融合，我们构建了一种以DNA为模板的BRET信号模块。在该模块中，锌指结构域融合的能量供体和受体可同时与双链DNA分子进行序列特异性识别。上述识别作用可使供体与受体的空间距离达到能量转移的临界距离，从而产生可检测的BRET信号。该模块的构建有望实现BRET技术与核酸检测体系的兼容，并为设计新的BRET检测方法奠定了基础。
2.以DNA为模板的BRET信号模块的优化
以上述工作为基础，我们进一步对供体和受体的空间取向和距离对最终能量转移效率的影响进行了分析，并最终对BRET信号模块的关键参数进行了优化。通过将Zif-268和AZP-4分别与Nluc和mNeonGreen的N-端和C-端进行融合，我们得到了不同类型的供体和受体。进一步将上述供体和受体两两组合构建BRET信号模块可发现，锌指结构域在DNA模板上的结合取向与亲和力是影响能量供体和受体在DNA模板上能量转移效率的关键因素。此外，能量供体和受体在DNA模板上的空间距离和体系中两者的比例关系也对最终的能量转移效率具有显著影响。通过对以上规律的分析，我们最终获得了能量转移效率最高的BRET信号模块，其构造如下：
1）能量供体：Zif-268融合于Nluc的N-端；
2）能量受体：AZP-4融合于mNeonGreen的C-端；
3）供体/受体空间距离：20 bp；
4）供体/受体比例：1:10。
3.以DNA为模板的BRET/FRET信号模块的构建
由于Nluc和mNeonGreen的发射光谱具有一定的重叠，因此基于它们构建的BRET体系仍然存在信噪比偏低的问题。为了解决上述问题，我们进一步设计了一种以 DNA为模板的 BRET/FRET信号模块。在该模块中，我们将 Zif-268结构域、Nluc和mNeonGreen融合为三聚体蛋白。通过该蛋白与嵌合有红色荧光染料BOBO-3的双链DNA进行结合，不仅实现了Nluc和mNeonGreen之间的BRET，还可同时实现mNeonGreen与BOBO-3的FRET。由于BOBO-3的最大发射光波长与Nluc和mNeonGreen的发射光谱几乎不存在重叠问题，因此上述体系可显著提高检测的信噪比。此外，与传统的FRET技术不同，以DNA为模板的BRET/FRET信号模块无需外部光源的激发，因此避免了激发光引起的生物自荧光、光漂白和光毒性等问题。
4.基于转录激活子样效应因子（Transcription Activator Like Effectors，TALEs）蛋白的生物发光体系的构建
由于锌指结构域存在DNA识别序列较短、亲和力较低以及可操作性较差的问题，因此在接下来的工作中我们进一步利用性能更加优异的 TALE蛋白作为DNA识别原件，构建了一种新的蛋白质/DNA生物发光体系。为此，我们将TALE蛋白的N-端和C-端编码序列与Nluc编码序列进行了融合，并最终通过Golden Gate克隆技术构建了同时具有生物发光和DNA识别功能的融合蛋白。该工作为进一步扩展生物发光技术与DNA检测体系的兼容性，并为构建更加可控的BRET检测体系奠定了基础。
1.以DNA为模板的BRET信号模块的构建
通过将锌指结构域 Zif-268和 AZP-4分别与能量供体萤光素酶 Nluc（NanoLuciferase，Nluc）和受体黄绿色荧光蛋白（mNeonGreen）进行融合，我们构建了一种以DNA为模板的BRET信号模块。在该模块中，锌指结构域融合的能量供体和受体可同时与双链DNA分子进行序列特异性识别。上述识别作用可使供体与受体的空间距离达到能量转移的临界距离，从而产生可检测的BRET信号。该模块的构建有望实现BRET技术与核酸检测体系的兼容，并为设计新的BRET检测方法奠定了基础。
2.以DNA为模板的BRET信号模块的优化
以上述工作为基础，我们进一步对供体和受体的空间取向和距离对最终能量转移效率的影响进行了分析，并最终对BRET信号模块的关键参数进行了优化。通过将Zif-268和AZP-4分别与Nluc和mNeonGreen的N-端和C-端进行融合，我们得到了不同类型的供体和受体。进一步将上述供体和受体两两组合构建BRET信号模块可发现，锌指结构域在DNA模板上的结合取向与亲和力是影响能量供体和受体在DNA模板上能量转移效率的关键因素。此外，能量供体和受体在DNA模板上的空间距离和体系中两者的比例关系也对最终的能量转移效率具有显著影响。通过对以上规律的分析，我们最终获得了能量转移效率最高的BRET信号模块，其构造如下：
1）能量供体：Zif-268融合于Nluc的N-端；
2）能量受体：AZP-4融合于mNeonGreen的C-端；
3）供体/受体空间距离：20 bp；
4）供体/受体比例：1:10。
3.以DNA为模板的BRET/FRET信号模块的构建
由于Nluc和mNeonGreen的发射光谱具有一定的重叠，因此基于它们构建的BRET体系仍然存在信噪比偏低的问题。为了解决上述问题，我们进一步设计了一种以 DNA为模板的 BRET/FRET信号模块。在该模块中，我们将 Zif-268结构域、Nluc和mNeonGreen融合为三聚体蛋白。通过该蛋白与嵌合有红色荧光染料BOBO-3的双链DNA进行结合，不仅实现了Nluc和mNeonGreen之间的BRET，还可同时实现mNeonGreen与BOBO-3的FRET。由于BOBO-3的最大发射光波长与Nluc和mNeonGreen的发射光谱几乎不存在重叠问题，因此上述体系可显著提高检测的信噪比。此外，与传统的FRET技术不同，以DNA为模板的BRET/FRET信号模块无需外部光源的激发，因此避免了激发光引起的生物自荧光、光漂白和光毒性等问题。
4.基于转录激活子样效应因子（Transcription Activator Like Effectors，TALEs）蛋白的生物发光体系的构建
由于锌指结构域存在DNA识别序列较短、亲和力较低以及可操作性较差的问题，因此在接下来的工作中我们进一步利用性能更加优异的 TALE蛋白作为DNA识别原件，构建了一种新的蛋白质/DNA生物发光体系。为此，我们将TALE蛋白的N-端和C-端编码序列与Nluc编码序列进行了融合，并最终通过Golden Gate克隆技术构建了同时具有生物发光和DNA识别功能的融合蛋白。该工作为进一步扩展生物发光技术与DNA检测体系的兼容性，并为构建更加可控的BRET检测体系奠定了基础。