豌豆根瘤菌c-细胞色素napC基因的功能研究

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NapC属于NapC/NirT膜结合二聚体c型细胞色素,在周质空间能将电子从醌转移到电子受体。NapC参与Fe(III)、延胡索酸盐和硝酸盐还原。根瘤菌是能在微氧、好氧和共生条件下生活的革兰氏阴性细菌,能与豆科植物建立共生固氮体系,在此过程中涉及一系列的电子传递链,同时需要维持固氮酶的低氧环境。通过生物信息分析,豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum) RL3841中含有一个napC基因napC(RL1631)。本研究通过基因同源重组技术,构建napC基因突变体,研究napC基因在自生、抗氧化胁迫和共生固氮条件下的功能。
  将napC基因克隆到自杀载体pK19mob上,得到重组质粒pKnapC。再经三亲本接合实验,通过单交换将重组质粒整合到根瘤菌基因组中,成功获得 napC基因突变株RLnapC。将napC全长基因片段克隆到载体pBBRMCS1-5中,获得重组质粒pBBRnapC-hb。进一步将重组质粒转入突变株RLnapC,从而获得回复菌株RLnapC-hb。
  在以葡萄糖或各种氨基酸为唯一碳源的AMS基本培养基中,napC基因突变对根瘤菌在好氧和微好氧条件下生长都没有影响。氧化物胁迫实验结果表明,在好氧条件下,经0.5 mM H2O2处理菌株,napC缺失对根瘤菌的存活率没有影响,但在厌氧条件下,与野生株RL3841相比,突变株RLnapC的存活率显著降低。表明在厌氧条件下,napC基因在根瘤菌抵御氧化物胁迫中发挥重要作用。
  通过植物盆栽实验,研究了napC基因对根瘤菌共生固氮功能的影响。虽然napC基因突变株形成红色根瘤,但是突变株有很弱的根圈定殖和竞争结瘤能力。与野生株RL3841相比,突变株形成4周和7周根瘤的固氮酶活分别下降了35%和46%。将4周的根瘤用于石蜡切片及超薄切片,观察根瘤及类菌体形态。结果表明:根瘤形态发生变形,napC基因突变株根瘤含类菌体细胞数明显减少,并且部分类菌体呈现出降解状态,表明napC基因在根瘤类菌体分化和防止根瘤过早衰亡中发挥重要作用。
  通过荧光定量RT-PCR实验,研究napC基因在根瘤菌抗氧化物胁迫和共生不同时期的表达。实验分析发现,napC基因在根瘤形成的早、中和晚期表达量分别为10.41,3.53和2.56,均显著提高。在H2O2胁迫和厌氧条件同时存在下,相关基因表达没有显著差异。另外,在接种4周豌豆植株中,与野生型RL3841相比,突变株根瘤只有固氮基因nifH显著降低。相比之下,7周豌豆植株中katG, humS,nifH和dmtH等基因的表达量都显著下降,表明napC基因在根瘤固氮和防止根瘤过早衰亡中发挥重要作用。
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