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荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)是指在一定的距离范围内(10-100?)，荧光供体与受体发生非辐射能量转移的过程。该过程导致供体荧光强度减弱，受体被激发或不被激发出荧光。该技术因其响应速度快、操作简便、不需要清洗等特点被广泛应用在分析检测、生物传感、光学成像等领域。在基于cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid)的FRET检测方法的开发过程中,或通过cDNA与待测物的竞争间接对待测物进行检测，或通过cDNA触发链置换反应间接检测目标物。因此cDNA的优化设计就非常必要，它对于方法灵敏度的提高具有非常重要的作用，然而较少有研究者对其进行较为全面的优化设计。另外，一般方法多通过单峰的OFF-ON或ON-OFF的荧光信号对待测物进行检测，然而荧光信号易受多种因素影响，这对于定量检测目标物是不利的。为解决这些问题以及方便相关方法的研究建立，本研究建立了一种基于适配体和cDNA的比率型FRET检测方法。
赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA)是一种主要由曲霉菌和青霉菌产生的真菌毒素，容易污染多种食品和中药材，如谷类、葡萄酒、咖啡、甘草、肉豆蔻等。研究表明，OTA对人体具有较强的致癌、致畸和肝肾毒性，被归为潜在的2B类致癌物，严重威胁着人类的生命健康。因此，开发一种快速、简便、灵敏度高、选择性强、可靠的OTA分析检测方法是非常必要的。
核酸适配体是指由指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术在体外筛选的、可特异性识别目标分子的单链核酸序列。近些年，适配体因其亲和力高、特异性强、易合成修饰、成本低等特点而多被用做捕获探针分析待测物。它可以兼容多种信号模式，如荧光、电化学、质谱、比色等，进而可以发展多种检测方法实现对目标物的检测。
基于此，本研究建立了一种基于OTA的适配体(OTA-Apt)及其cDNA的比率型FRET分析方法。在该方法的建立过程中，系统完善了基于cDNA的FRET检测方法的建立。使用荧光光谱测定FRET体系的荧光响应情况，圆二色光谱(Circular Dichroism, CD)、分子动力学模拟辅助验证部分实验，从位置、长度、碱基序列层面对cDNA进行了较全面的设计研究，最终优化出一条cDNA序列，该cDNA序列的荧光响应比值均高于优化过程的其他cDNA，检测限低至3.9nM。
本文主要分为以下三部分：
第一章为前言。介绍了荧光共振能量转移技术的原理、需要满足的条件、分类和发展；描述了cDNA在FRET方法建立中的应用；描述了适配体的特点及应用；综述了赭曲霉毒素A的危害、分布及检测方法。
第二章为基于适配体和cDNA的比率型FRET荧光方法的设计和构建。首先对修饰荧光基团的OTA-Apt、cDNA进行了紫外、荧光光谱的测定及相关计算比较，选择FAM(6-carboxyfluorescein)、ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine)分别修饰OTA-Apt、cDNA构成比率型荧光探针。其次，从cDNA的位置、长度、碱基序列角度出发，较全面地设计了一系列cDNA序列，将其引入FRET体系进行荧光光谱测定，使用CD光谱、分子动力学模拟从OTA-Apt构象、结合位点角度对其进行相关的辅助验证，最终确定了荧光响应比值最高的cDNA序列，认为该序列使得方法的检测灵敏度最高。
第三章为基于适配体和cDNA的比率型FRET方法优化及OTA样品检测的应用。包括pH值、金属阳离子在内的缓冲液条件的优化；FRET体系孵育的温度和时间的优化；OTA-Apt与cDNA的比例、浓度的优化；并进行了选择性、线性、回收率等一系列方法学验证。
赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA)是一种主要由曲霉菌和青霉菌产生的真菌毒素，容易污染多种食品和中药材，如谷类、葡萄酒、咖啡、甘草、肉豆蔻等。研究表明，OTA对人体具有较强的致癌、致畸和肝肾毒性，被归为潜在的2B类致癌物，严重威胁着人类的生命健康。因此，开发一种快速、简便、灵敏度高、选择性强、可靠的OTA分析检测方法是非常必要的。
核酸适配体是指由指数富集的配体系统进化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX)技术在体外筛选的、可特异性识别目标分子的单链核酸序列。近些年，适配体因其亲和力高、特异性强、易合成修饰、成本低等特点而多被用做捕获探针分析待测物。它可以兼容多种信号模式，如荧光、电化学、质谱、比色等，进而可以发展多种检测方法实现对目标物的检测。
基于此，本研究建立了一种基于OTA的适配体(OTA-Apt)及其cDNA的比率型FRET分析方法。在该方法的建立过程中，系统完善了基于cDNA的FRET检测方法的建立。使用荧光光谱测定FRET体系的荧光响应情况，圆二色光谱(Circular Dichroism, CD)、分子动力学模拟辅助验证部分实验，从位置、长度、碱基序列层面对cDNA进行了较全面的设计研究，最终优化出一条cDNA序列，该cDNA序列的荧光响应比值均高于优化过程的其他cDNA，检测限低至3.9nM。
本文主要分为以下三部分：
第一章为前言。介绍了荧光共振能量转移技术的原理、需要满足的条件、分类和发展；描述了cDNA在FRET方法建立中的应用；描述了适配体的特点及应用；综述了赭曲霉毒素A的危害、分布及检测方法。
第二章为基于适配体和cDNA的比率型FRET荧光方法的设计和构建。首先对修饰荧光基团的OTA-Apt、cDNA进行了紫外、荧光光谱的测定及相关计算比较，选择FAM(6-carboxyfluorescein)、ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine)分别修饰OTA-Apt、cDNA构成比率型荧光探针。其次，从cDNA的位置、长度、碱基序列角度出发，较全面地设计了一系列cDNA序列，将其引入FRET体系进行荧光光谱测定，使用CD光谱、分子动力学模拟从OTA-Apt构象、结合位点角度对其进行相关的辅助验证，最终确定了荧光响应比值最高的cDNA序列，认为该序列使得方法的检测灵敏度最高。
第三章为基于适配体和cDNA的比率型FRET方法优化及OTA样品检测的应用。包括pH值、金属阳离子在内的缓冲液条件的优化；FRET体系孵育的温度和时间的优化；OTA-Apt与cDNA的比例、浓度的优化；并进行了选择性、线性、回收率等一系列方法学验证。