靶向组蛋白赖氨酸甲基化识别蛋白53BP1-TTD小分子抑制剂的发现与分子机制研究

• 作 者: 孙彦丽
• 机 构: 烟台大学
• 出 处: 烟台大学
• 发表日期: 2021年01期
• 关键词: 药物化学

目的：
　　p53结合蛋白1(p53Binding Protein1,53BP1)是一种肿瘤抑制因子，其含有两个串联的都铎结构域(Tantem Tudor domain TTD)，通过特异性识别组蛋白上赖氨酸甲基化来参与DNA损伤修复(DNA Damage Repair,DDR)通路。53BP1的失调与许多疾病的发生发展密切相关，特别是肿瘤。此外，最近的研究发现53BP1缺失可以提高CRISPR/Cas9基因编辑的精确效率。因此，53BP1抑制剂的发现有利于对其生物学功能的研究和CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用。已被报道的UNC2170及其衍生物是靶向53BP1-TTD的小分子抑制剂，其体外体内活性较差，仍不能作为有效的抑制剂。因此，开发结构新颖、活性强的新型53BP1小分子抑制剂具有重大意义。
　　方法：
　　在本论文中主要包括三部分。第一部分：为发现结构新颖且有效的小分子抑制剂，建立了AlphaScreen体外生物化学方法作为高通量筛选平台。第二部分：基于AlphaScreen筛选平台对实验室含有丰富结构骨架的3447个化合物进行筛选，运用微量热泳动（MST）和等离子体共振(SPR）体外生物方法检测苗头化合物DP308与53BP1蛋白的亲和力，并通过DP308及其衍生物的构效关系(SARs)和分子对接技术分析DP308与53BP1-TTD蛋白的结合模式。第三部分：优化53BP1-TTD的结晶条件，探索化合物DP308和53BP1-TTD复合物晶体。
　　结果：
　　AlphaScreen实验结果显示，我们建立了可靠地高稳定性筛选平台，其中Z’factor为0.82，S/B为10.01，阳性多肽以及阳性抑制剂UNC2170的抑制率也符合已报道的活性结果，并且成功发现了一个结构新颖且有效的苗头化合物，DP308，IC50=1.69±0.73μM。
　　MST和SPR结果显示：MST和SPR的实验分别测得DP308与53BP1蛋白的亲和力(Kd)为2.69μM和2.71μM，表明DP308与53BP1蛋白在体外直接结合并有较好的亲和力。
　　SARs和分子对接结果显示：小分子抑制剂DP308与53BP1-TTD蛋白的芳香笼相互作用，占据了底物口袋。
　　结论：
　　本研究中，作者基于AlphaScreen高通量筛选平台，发现了一种结构新颖且有效的53BP1-TTD小分子抑制剂(DP308)。进一步的分子对接和构效分析全面解释了DP308与53BP1-TTD蛋白的结合模式。根据以上研究的结果，喹啉是DP308与53BP1-TTD蛋白的第一个Tudor结构域的芳香笼相互作用的重要结构，此外，酰胺NH与第二个Tudor结构域的第1584位的甲硫氨酸(Met1584)之间形成的氢键进一步稳定了相互作用。DP308识别并结合在53BP1-TTD蛋白的两个串联Tudor结构域，它们的结合模式与53BP1-TTD-H4K20me2相似，这可能是DP308在体外比UNC2170抑制53BP1-TTD蛋白更有效的原因。综上所述，DP308是一种有效的53BP1-TTD蛋白的小分子抑制剂，并且有望成为研究53BP1生物学功能的候选化学探针。
　　创新点：
　　本课题通过建立的AlphaScreen高通量筛选平台发现了结构新颖且有效的先导化合物DP308，运用计算机药物设计学，结合分子对接技术对先导化合物进行分析构效和结构优化，这丰富了53BP1-TTD蛋白的小分子抑制剂类型。