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芫花（Daphne genkwa Sieb.et Zucc）为瑞香科（Thymelaeaceae）瑞香属植物，作为中国传统民间用药已有2000多年的历史。《中药大辞典》中亦有记载芫花根具有逐水、解毒之功效，对于水肿、风湿痹痛、疥疮等有较好疗效，临床上常用于治疗急性乳腺炎、鼻炎等。芫花根中的倍半萜类化合物是其发挥抗炎活性的主要成分，但这类结构的天然化合物的抗炎分子机制尚不明确。本课题组采用分子对接以及Griess法，优选出从芫花根中提取的倍半萜类化合物，并对其体外抗炎活性及其发挥抗炎作用的分子机制进行深入研究，有助于芫花药用资源合理的开发和利用。
采用分子对接的方法对已分离鉴定的10个倍半萜类单体化合物进行对接打分并且采用Griess法检测10个单体化合物对LPS诱导巨噬细胞释放炎症介质一氧化氮（NO）的抑制活性同时运用MTT法检测10个单体化合物对RAW264.7细胞的细胞毒性，根据分子对接、NO抑制活性以及细胞毒性的实验结果，选出高效低毒的活性化合物，并对活性化合物进行深入研究。运用ELISA法检测活性化合物对炎症介质前列腺素E2（PGE2）和炎症因子TNF-α以及IL-6过量释放的抑制作用；采用Western Blot法检测活性化合物对炎症蛋白iNOS和COX-2蛋白高表达和对NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解以及MAPK通路中的ERK、JNK、p38蛋白磷酸化的调控作用，采用分子对接法分析化合物与靶标蛋白（iNOS、COX-2、JNK、ERK、p38等）结合的氨基酸残基的活性位点以及主要作用力。
分子对接打分结果显示，愈创木烷型倍半萜（1、2、4）和菖蒲烷型倍半萜（7）总分排名比较靠前，同时采用Griess法进行验证检测了10个单体化合物在100μM浓度下对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放炎症介质一氧化氮（NO）的抑制活性。愈创木烷型倍半萜（1、2、4）和菖蒲烷型倍半萜（7）表现出较好的抑制活性，这与分子对接的结果较为一致，MTT平行实验结果表明该化合物在此浓度下对RAW264.7细胞无细胞毒性。
根据初筛实验结果显示，挑选出2个愈创木烷型类倍半萜（2和4）和1个菖蒲烷型倍半萜（7）为活性化合物进行更深入的研究，Griess和ELISA实验结果表明：愈创木烷型类倍半萜（2和4）和菖蒲烷型倍半萜（7）均能抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放因子NO、PGE2和TNF-α。化合物2在6.25μM~25μM时对LPS诱导产生的IL-6有显著抑制作用；化合物7在12.5μM~25μM时对LPS诱导产生的IL-6有显著抑制作用，而化合物4仅在高浓度50μM时对LPS诱导产生的IL-6有显著抑制作用。Western Blot实验结果显示，化合物（2、4和7）均能显著下调LPS诱导的iNOS、COX-2蛋白高表达；化合物2对MAPK信号通路中的p38,JNK蛋白的磷酸化均有一定抑制作用；化合物7对MAPK信号通路中的ERK,JNK蛋白的磷酸化亦有一定的抑制作用；而化合物4仅对MAPK信号通路中JNK蛋白的磷酸化有抑制作用；三个化合物（2、4和7）对LPS诱导的NF-κB/IκB-α降解均无显著抑制作用。根据Western Blot的实验结果，挑选出可调控炎症蛋白高表达的化合物，采用分子对接的方法寻找化合物与炎症相关靶标蛋白（iNOS、COX-2、JNK、ERK、p38）结合的氨基酸残基的活性位点及其主要作用力。
综上所述，愈创木烷型倍半萜（2和4）以及菖蒲烷型倍半萜7通过抑制MAPK信号通路的激活下调炎症蛋白iNOS,COX-2的表达以及炎症因子的产生发挥抗炎作用而对NF-κB通路的激活无任何影响。对接结果发现，Arg388,Trp188,Asp376是化合物与iNOS发生相互作用时的主要氨基酸残基活性位点；Arg120和Ser530是化合物作用于COX-2蛋白的主要氨基酸残基活性位点；化合物与JNK蛋白发生相互作用的主要氨基酸残基位点是Met111,Asn194,Asn152,Gln75,Gln37；与ERK蛋白发生相互作用时的主要氨基酸活性位点是Met108,Glu50和Ser170；与p38蛋白发生相互作用时的主要氨基酸残基活性位点为Lys53。
采用分子对接的方法对已分离鉴定的10个倍半萜类单体化合物进行对接打分并且采用Griess法检测10个单体化合物对LPS诱导巨噬细胞释放炎症介质一氧化氮（NO）的抑制活性同时运用MTT法检测10个单体化合物对RAW264.7细胞的细胞毒性，根据分子对接、NO抑制活性以及细胞毒性的实验结果，选出高效低毒的活性化合物，并对活性化合物进行深入研究。运用ELISA法检测活性化合物对炎症介质前列腺素E2（PGE2）和炎症因子TNF-α以及IL-6过量释放的抑制作用；采用Western Blot法检测活性化合物对炎症蛋白iNOS和COX-2蛋白高表达和对NF-κB信号通路中IκB-α蛋白的降解以及MAPK通路中的ERK、JNK、p38蛋白磷酸化的调控作用，采用分子对接法分析化合物与靶标蛋白（iNOS、COX-2、JNK、ERK、p38等）结合的氨基酸残基的活性位点以及主要作用力。
分子对接打分结果显示，愈创木烷型倍半萜（1、2、4）和菖蒲烷型倍半萜（7）总分排名比较靠前，同时采用Griess法进行验证检测了10个单体化合物在100μM浓度下对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7释放炎症介质一氧化氮（NO）的抑制活性。愈创木烷型倍半萜（1、2、4）和菖蒲烷型倍半萜（7）表现出较好的抑制活性，这与分子对接的结果较为一致，MTT平行实验结果表明该化合物在此浓度下对RAW264.7细胞无细胞毒性。
根据初筛实验结果显示，挑选出2个愈创木烷型类倍半萜（2和4）和1个菖蒲烷型倍半萜（7）为活性化合物进行更深入的研究，Griess和ELISA实验结果表明：愈创木烷型类倍半萜（2和4）和菖蒲烷型倍半萜（7）均能抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放因子NO、PGE2和TNF-α。化合物2在6.25μM~25μM时对LPS诱导产生的IL-6有显著抑制作用；化合物7在12.5μM~25μM时对LPS诱导产生的IL-6有显著抑制作用，而化合物4仅在高浓度50μM时对LPS诱导产生的IL-6有显著抑制作用。Western Blot实验结果显示，化合物（2、4和7）均能显著下调LPS诱导的iNOS、COX-2蛋白高表达；化合物2对MAPK信号通路中的p38,JNK蛋白的磷酸化均有一定抑制作用；化合物7对MAPK信号通路中的ERK,JNK蛋白的磷酸化亦有一定的抑制作用；而化合物4仅对MAPK信号通路中JNK蛋白的磷酸化有抑制作用；三个化合物（2、4和7）对LPS诱导的NF-κB/IκB-α降解均无显著抑制作用。根据Western Blot的实验结果，挑选出可调控炎症蛋白高表达的化合物，采用分子对接的方法寻找化合物与炎症相关靶标蛋白（iNOS、COX-2、JNK、ERK、p38）结合的氨基酸残基的活性位点及其主要作用力。
综上所述，愈创木烷型倍半萜（2和4）以及菖蒲烷型倍半萜7通过抑制MAPK信号通路的激活下调炎症蛋白iNOS,COX-2的表达以及炎症因子的产生发挥抗炎作用而对NF-κB通路的激活无任何影响。对接结果发现，Arg388,Trp188,Asp376是化合物与iNOS发生相互作用时的主要氨基酸残基活性位点；Arg120和Ser530是化合物作用于COX-2蛋白的主要氨基酸残基活性位点；化合物与JNK蛋白发生相互作用的主要氨基酸残基位点是Met111,Asn194,Asn152,Gln75,Gln37；与ERK蛋白发生相互作用时的主要氨基酸活性位点是Met108,Glu50和Ser170；与p38蛋白发生相互作用时的主要氨基酸残基活性位点为Lys53。