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随着对肿瘤免疫学研究的深入，癌症免疫疗法正在成为癌症治疗的重要手段。免疫治疗的目的是重新激活机体免疫系统。其中，CD8+T细胞介导的免疫应答在肿瘤的免疫清除中起主要作用。然而T细胞和肿瘤细胞表面表达多种免疫检查点分子，如程序性死亡受体1(programmed cell death protein，PD-1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)等，介导免疫抑制并发生免疫逃逸。尽管免疫检查点阻断已被证明具有巨大的治疗潜力，但临床应用仍然存在多种限制。肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)的异质性、衰竭T细胞的低应答率和多种免疫抑制性细胞间的复杂调控网络使得单靶点治疗的效果不尽人意。而利用纳米给药系统可以协同递送药物实现多靶点调节。在本课题中，我们描述了一种基于多肽的胶束系统，包封了芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)抑制剂CH223191，并在多肽结构中引入了基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)敏感肽段连接了anti-CD28以在肿瘤微环境响应释放增加T细胞激活必需的共刺激信号。AhR阻断可以下调CD8+T细胞的PD-1表达，解除免疫抑制，并且可以降低乳腺癌细胞的增殖活性及转移性。而anti-CD28可以增加共刺激信号，有效提高T细胞活化效率，协同AhR的免疫调节作用，恢复抗肿瘤免疫，达到多通路协同抑制肿瘤生长的目的。我们对纳米免疫调节胶束的制备过程以及体内外的免疫调节及抗乳腺癌效果进行了系统性的评价。
本课题主要分为三个章节，第一章是共载免疫胶束的构建及表征。首先采用固相合成法合成了序列为stearyl-HHHRRRRRPLGLAGK-(Mal)的多肽单体(简称SHRP)并对其纯度及分子量进行了检测和鉴定，结果显示多肽单体成功合成且纯度较高。然后采用乳化溶剂蒸发法制备了包载CH223191的胶束体系SHRP-CH；下一步通过多肽的-Mal基团与巯基化处理后的anti-CD28反应将抗体缀合至胶束形成了共载免疫胶束Dual-SHRP。制备所得的SHRP胶束的临界胶束浓度(Critical micelle concentration , CMC)约为0.1μg/mL，可以有效避免因为体液的稀释而导致药物泄露。接下来我们对合成的胶束进行了表征。制备得SHRP的粒径约为124nm，经过载药后所得的Dual-SHRP粒径增加至162nm左右。在经过MMP处理后，酶敏感肽段断裂，胶束(MMP-Dual)的粒径减少至88nm。透射电镜下观察SHRP及Dual-SHRP均呈现球形结构，MMP-Dual仍能保持类球形结构。测得Dual-SHRP中CH223191的载药量及anti-CD28的抗体连接量分别为(7.18±1.2)%和(5.3±0.37)%。最后对两种药物的体外释放情况进行了考察。
第二章节对Dual-SHRP的体外生物活性、免疫调节作用及抗乳腺癌作用等进行了初步考察。首先对SHRP的免疫原性进行了考察，结果证实SHRP无免疫原性不会刺激免疫系统产生免疫反应。对anti-CD28的生物学功能进行验证，流式细胞术结果证实了anti-CD28连接至SHRP后其和CD28分子结合并产生传递共刺激信号的能力未受影响。细胞摄取实验结果证实阳离子胶束更容易被细胞摄取内化，且MMP-Dual的细胞摄取效率更高，可以提高CH223191的药效发挥，与体外抗4T1细胞迁移结果及CD8+T细胞PD-1表达实验结果一致。最后，为了模拟TME的免疫衰竭状态，提前体外诱导CD8+T细胞衰竭并构建了CD8+T和4T1细胞的共培养体系，经过不同给药组处理后检测肿瘤细胞的凋亡情况，结果显示，Dual-SHRP可以有效解除免疫抑制恢复C8+T细胞的肿瘤杀伤作用。
第三章节对Dual-SHRP的体内抗肿瘤效果及免疫调节机制进行了研究。首先构建了荷载4T1细胞的小鼠乳腺癌原位移植瘤模型。活体成像结果显示Dual-SHRP和游离药物相比可以更多的蓄积在肿瘤部位。肿瘤体积生长曲线变化及生存期考察实验证实了Dual-SHRP可以有效的抑制小鼠肿瘤生长。HE染色及血生化指标检测结果验证了Dual-SHRP的生物安全性。最后对Dual-SHRP的免疫调节机制进行了考察，结果显示Dual-SHRP可以有效增加肿瘤淋巴浸润，提高细胞毒性CD8+T细胞的数量、减少抑制性免疫细胞亚群的比例以及增加相关抗肿瘤细胞因子的分泌。
综上所述，我们构建了基于多肽的MMP-2敏感共载免疫胶束体系Dual-SHRP，可以有效调控抑制性的肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)并发挥抗乳腺癌作用。胶束可以通过被动靶向蓄积在肿瘤部位，体内外实验结果表明，Dual-SHRP可以有效的抑制小鼠乳腺癌肿瘤生长，提高肿瘤内部CD8+T细胞的百分率，并降低免疫抑制淋巴细胞的比例。本课题探索了AhR调节联合增加共刺激信号在调节肿瘤微环境免疫力的潜力，开发的胶束体系是一种新的、有效的肿瘤免疫治疗策略，也为免疫调节剂的递送提供了一种新的纳米平台。
本课题主要分为三个章节，第一章是共载免疫胶束的构建及表征。首先采用固相合成法合成了序列为stearyl-HHHRRRRRPLGLAGK-(Mal)的多肽单体(简称SHRP)并对其纯度及分子量进行了检测和鉴定，结果显示多肽单体成功合成且纯度较高。然后采用乳化溶剂蒸发法制备了包载CH223191的胶束体系SHRP-CH；下一步通过多肽的-Mal基团与巯基化处理后的anti-CD28反应将抗体缀合至胶束形成了共载免疫胶束Dual-SHRP。制备所得的SHRP胶束的临界胶束浓度(Critical micelle concentration , CMC)约为0.1μg/mL，可以有效避免因为体液的稀释而导致药物泄露。接下来我们对合成的胶束进行了表征。制备得SHRP的粒径约为124nm，经过载药后所得的Dual-SHRP粒径增加至162nm左右。在经过MMP处理后，酶敏感肽段断裂，胶束(MMP-Dual)的粒径减少至88nm。透射电镜下观察SHRP及Dual-SHRP均呈现球形结构，MMP-Dual仍能保持类球形结构。测得Dual-SHRP中CH223191的载药量及anti-CD28的抗体连接量分别为(7.18±1.2)%和(5.3±0.37)%。最后对两种药物的体外释放情况进行了考察。
第二章节对Dual-SHRP的体外生物活性、免疫调节作用及抗乳腺癌作用等进行了初步考察。首先对SHRP的免疫原性进行了考察，结果证实SHRP无免疫原性不会刺激免疫系统产生免疫反应。对anti-CD28的生物学功能进行验证，流式细胞术结果证实了anti-CD28连接至SHRP后其和CD28分子结合并产生传递共刺激信号的能力未受影响。细胞摄取实验结果证实阳离子胶束更容易被细胞摄取内化，且MMP-Dual的细胞摄取效率更高，可以提高CH223191的药效发挥，与体外抗4T1细胞迁移结果及CD8+T细胞PD-1表达实验结果一致。最后，为了模拟TME的免疫衰竭状态，提前体外诱导CD8+T细胞衰竭并构建了CD8+T和4T1细胞的共培养体系，经过不同给药组处理后检测肿瘤细胞的凋亡情况，结果显示，Dual-SHRP可以有效解除免疫抑制恢复C8+T细胞的肿瘤杀伤作用。
第三章节对Dual-SHRP的体内抗肿瘤效果及免疫调节机制进行了研究。首先构建了荷载4T1细胞的小鼠乳腺癌原位移植瘤模型。活体成像结果显示Dual-SHRP和游离药物相比可以更多的蓄积在肿瘤部位。肿瘤体积生长曲线变化及生存期考察实验证实了Dual-SHRP可以有效的抑制小鼠肿瘤生长。HE染色及血生化指标检测结果验证了Dual-SHRP的生物安全性。最后对Dual-SHRP的免疫调节机制进行了考察，结果显示Dual-SHRP可以有效增加肿瘤淋巴浸润，提高细胞毒性CD8+T细胞的数量、减少抑制性免疫细胞亚群的比例以及增加相关抗肿瘤细胞因子的分泌。
综上所述，我们构建了基于多肽的MMP-2敏感共载免疫胶束体系Dual-SHRP，可以有效调控抑制性的肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment, TIME)并发挥抗乳腺癌作用。胶束可以通过被动靶向蓄积在肿瘤部位，体内外实验结果表明，Dual-SHRP可以有效的抑制小鼠乳腺癌肿瘤生长，提高肿瘤内部CD8+T细胞的百分率，并降低免疫抑制淋巴细胞的比例。本课题探索了AhR调节联合增加共刺激信号在调节肿瘤微环境免疫力的潜力，开发的胶束体系是一种新的、有效的肿瘤免疫治疗策略，也为免疫调节剂的递送提供了一种新的纳米平台。