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仿刺参是中国重要的水产养殖经济品种,河流和降雨引起的海水盐度变化,对仿刺参产业具有重要影响。基于盐度胁迫后cDNA文库的测序结果,获得了差异表达的基因、miRNA和lncRNA,论文选取了2个显著差异的miRNA,并分析了其对应的靶基因及lncRNA,探索其在盐度适应中发挥的功能,获得了以下研究结果:
(1)低盐胁迫结果表明miR-10与TBC1D5的表达量与低盐胁迫存在着一定的关系。随后通过TBC1D5保守的结合位点和双萤光素酶报告分析表明了miR-10与TBC1D5存在靶向关系,并且在体内和体外干扰结果表明miR-10与TBC1D5有着负调控关系。在体外结果中,体腔细胞转染inhibitor-10后,除了胁迫后24小时外miR-10与TBC1D5仍然着负调控关系;转染mimics-10后,胁迫后的TBC1D5摆脱了高表达miR-10的限制。而在体内结果中,转染antagomir-10后TBC1D5与miR-10调控关系依然存在;在转染agomir-10后,miR-10也一直调控TBC1D5。对于离子浓度来说,转染后各组离子浓度差异性不大。在NKA酶活力方面,转染antagomir-10后,正常盐度下,miR-10表达量低于对照组时,NKA酶活力高于对照组;低盐胁迫后,miR-10表达量与NKA酶活力呈正相关。在转染agomir-10后,低盐胁迫后24小时前,miR-10表达量与NKA酶活力呈正相关,在胁迫后48小时miR-10表达量与NKA酶活力呈负相关。提示,miR-10可能调控TBC1D5参与仿刺参对盐度的适应机制。
(2)双萤光素酶报告基因检测证明let-7与NKAα和lncRNA001074具有靶向关系。体内和体外结果表明,let-7与NKAα有着负调控关系,lncRNA001074反式作用调节NKAα表达。
(3)lncRNA001074-let-7-NKAα低盐胁迫下的功能性分析结果表明,在整个低盐胁迫过程中,lncRNA001074为了稳定NKAα在仿刺参体内的下调表达,其表达量在胁迫过程中上升,竞争性结合let-7,从而降低了let-7的表达量。NKA酶活力分析结果表明,低盐胁迫后48小时let-7的低表达量和lncRNA001074的高表达量与NKA酶的高活力有一定相关性。提示,仿刺参可能通过let-7和NKAα的低表达和lncRNA001074的高表达来提高仿刺参的NKA酶活力进而来协调机体适应环境盐度的变化。
(1)低盐胁迫结果表明miR-10与TBC1D5的表达量与低盐胁迫存在着一定的关系。随后通过TBC1D5保守的结合位点和双萤光素酶报告分析表明了miR-10与TBC1D5存在靶向关系,并且在体内和体外干扰结果表明miR-10与TBC1D5有着负调控关系。在体外结果中,体腔细胞转染inhibitor-10后,除了胁迫后24小时外miR-10与TBC1D5仍然着负调控关系;转染mimics-10后,胁迫后的TBC1D5摆脱了高表达miR-10的限制。而在体内结果中,转染antagomir-10后TBC1D5与miR-10调控关系依然存在;在转染agomir-10后,miR-10也一直调控TBC1D5。对于离子浓度来说,转染后各组离子浓度差异性不大。在NKA酶活力方面,转染antagomir-10后,正常盐度下,miR-10表达量低于对照组时,NKA酶活力高于对照组;低盐胁迫后,miR-10表达量与NKA酶活力呈正相关。在转染agomir-10后,低盐胁迫后24小时前,miR-10表达量与NKA酶活力呈正相关,在胁迫后48小时miR-10表达量与NKA酶活力呈负相关。提示,miR-10可能调控TBC1D5参与仿刺参对盐度的适应机制。
(2)双萤光素酶报告基因检测证明let-7与NKAα和lncRNA001074具有靶向关系。体内和体外结果表明,let-7与NKAα有着负调控关系,lncRNA001074反式作用调节NKAα表达。
(3)lncRNA001074-let-7-NKAα低盐胁迫下的功能性分析结果表明,在整个低盐胁迫过程中,lncRNA001074为了稳定NKAα在仿刺参体内的下调表达,其表达量在胁迫过程中上升,竞争性结合let-7,从而降低了let-7的表达量。NKA酶活力分析结果表明,低盐胁迫后48小时let-7的低表达量和lncRNA001074的高表达量与NKA酶的高活力有一定相关性。提示,仿刺参可能通过let-7和NKAα的低表达和lncRNA001074的高表达来提高仿刺参的NKA酶活力进而来协调机体适应环境盐度的变化。