论文部分内容阅读
异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是以方正银鲫为母本(♀)，用兴国红鲤作父本(♂)，经人工授精和异精雌核发育得到的子代，具有生长快速、抗逆性强、肉质好等优点，深受人们的喜爱。但随着养殖规模和集约化程度的不断扩大，病害问题也日益突出，其中以鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)引发的异育银鲫造血器官坏死症为甚，但目前尚缺少控制该病爆发的有效措施或药物。有关报道表明，聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid，Poly I:C)可以激活机体的一系列免疫反应，经过PolyI:C处理过的鱼在病毒感染后死亡率降低，然而，PolyI:C刺激对异育银鲫抗CyHV-2感染的保护作用及机制尚不清楚，因此本论文主要研究内容如下：
(1)从盐城市某养殖场采集到一例患病异育银鲫，病鱼呈现鳃部出血、体表脓包、黏液增多、眼球突出等症状，常规PCR检测表明脾脏中CyHV-2DNA阳性。取感染CyHV-2的异育银鲫脾脏制备病毒匀浆液，进行人工感染实验。人工感染实验前24h在异育银鲫腹腔内注射不同剂量的PolyI:C，研究结果表明，在注射浓度为5μg/g、10μg/g的异育银鲫中，浓度越高死亡率越低，死亡高峰越较晚发生，这表明PolyI:C可以降低患病异育银鲫的死亡率并且使死亡高峰延迟。
(2)为了研究在PolyI:C处理后哪些基因起着重要的作用，我们分别用PolyI:C和PBS对异育银鲫进行刺激，24h后提取脾脏DNA，构建cDNA文库，进行RNA-Seq测序，转录组学分析共获得1286个差异基因，其中上调基因1006个，下调基因280个。GO富集分析表明，差异基因主要富集于“生物调节”，“转录因子活性”和“G蛋白偶联受体信号”等功能类别中；KEGG富集分析表明，差异基因主要富集在“TNF信号通路”、“JAK-STAT信号通路”、“P53信号通路”等免疫相关信号通路中。
(3)我们采用Hoechst33258染色法观察TNF-α蛋白对鲫鱼鳍条细胞的影响。TNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞后，在处理后的第24h，处理组细胞的细胞核出现弥散、边界不清等典型的细胞凋亡变化，说明TNF-α蛋白能够引起鲫鱼鳍条细胞发生凋亡。我们进一步用TNF-α蛋白处理鳍条细胞，选取处理后不同的时间点的样品进行基因表达分析。结果表明，Caspase8和Caspase3基因的表达水平在第6h后开始上调，到第24h时达到高峰，随后逐渐下降。表明了异育银鲫TNF-α蛋白通过激活Caspase信号通路进而诱导鲫鱼鳍条细胞发生凋亡。
综上所述，本论文从患病异育银鲫中提取脾脏DNA，PCR检测为CyHV-2阳性，制备病毒匀浆液，注射PolyI:C后进行人工感染实验，结果表明，在PolyI:C注射浓度为10μg/g时，异育银鲫死亡率最低。我们进一步对异育银鲫的脾脏进行转录组学分析，共获得1286个差异基因，其中上调基因1006个，下调基因280个，差异基因显著富集到与免疫相关的信号通路中。此外，我们用TNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞，在处理后的第24h，细胞发生了明显的凋亡变化，我们进一步利用TNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞，选取处理后不同的时间点的样品进行基因表达分析。结果表明，Caspase8和Caspase3基因的表达水平在第6h后开始上调，到第24h时达到高峰，随后逐渐下降。表明了异育银鲫TNF-α蛋白通过激活Caspase信号通路进而诱导鲫鱼鳍条细胞发生凋亡。本文的研究结果将有助于了解异育银鲫抗CyHV-2的感染机制，以及对鲫造血器官坏死症的防控都具有十分重要的意义。
(1)从盐城市某养殖场采集到一例患病异育银鲫，病鱼呈现鳃部出血、体表脓包、黏液增多、眼球突出等症状，常规PCR检测表明脾脏中CyHV-2DNA阳性。取感染CyHV-2的异育银鲫脾脏制备病毒匀浆液，进行人工感染实验。人工感染实验前24h在异育银鲫腹腔内注射不同剂量的PolyI:C，研究结果表明，在注射浓度为5μg/g、10μg/g的异育银鲫中，浓度越高死亡率越低，死亡高峰越较晚发生，这表明PolyI:C可以降低患病异育银鲫的死亡率并且使死亡高峰延迟。
(2)为了研究在PolyI:C处理后哪些基因起着重要的作用，我们分别用PolyI:C和PBS对异育银鲫进行刺激，24h后提取脾脏DNA，构建cDNA文库，进行RNA-Seq测序，转录组学分析共获得1286个差异基因，其中上调基因1006个，下调基因280个。GO富集分析表明，差异基因主要富集于“生物调节”，“转录因子活性”和“G蛋白偶联受体信号”等功能类别中；KEGG富集分析表明，差异基因主要富集在“TNF信号通路”、“JAK-STAT信号通路”、“P53信号通路”等免疫相关信号通路中。
(3)我们采用Hoechst33258染色法观察TNF-α蛋白对鲫鱼鳍条细胞的影响。TNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞后，在处理后的第24h，处理组细胞的细胞核出现弥散、边界不清等典型的细胞凋亡变化，说明TNF-α蛋白能够引起鲫鱼鳍条细胞发生凋亡。我们进一步用TNF-α蛋白处理鳍条细胞，选取处理后不同的时间点的样品进行基因表达分析。结果表明，Caspase8和Caspase3基因的表达水平在第6h后开始上调，到第24h时达到高峰，随后逐渐下降。表明了异育银鲫TNF-α蛋白通过激活Caspase信号通路进而诱导鲫鱼鳍条细胞发生凋亡。
综上所述，本论文从患病异育银鲫中提取脾脏DNA，PCR检测为CyHV-2阳性，制备病毒匀浆液，注射PolyI:C后进行人工感染实验，结果表明，在PolyI:C注射浓度为10μg/g时，异育银鲫死亡率最低。我们进一步对异育银鲫的脾脏进行转录组学分析，共获得1286个差异基因，其中上调基因1006个，下调基因280个，差异基因显著富集到与免疫相关的信号通路中。此外，我们用TNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞，在处理后的第24h，细胞发生了明显的凋亡变化，我们进一步利用TNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞，选取处理后不同的时间点的样品进行基因表达分析。结果表明，Caspase8和Caspase3基因的表达水平在第6h后开始上调，到第24h时达到高峰，随后逐渐下降。表明了异育银鲫TNF-α蛋白通过激活Caspase信号通路进而诱导鲫鱼鳍条细胞发生凋亡。本文的研究结果将有助于了解异育银鲫抗CyHV-2的感染机制，以及对鲫造血器官坏死症的防控都具有十分重要的意义。