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皮肤溃疡症是弧菌属感染海水养殖鱼类的主要表现，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是两种重要的致病菌，被感染鱼死亡率高影响范围广，且宿主范围逐年扩大，导致世界范围内养殖鱼类的重大损失。随着鱼类免疫学研究的不断深入与疫苗免疫技术的不断发展，鱼用疫苗正逐渐取代抗生素成为水产动物疫病防治的主流手段。本课题选取第一章筛选出的溶血力最强美人鱼发光杆菌与前期王庚申从患病许氏平鲉分离出的鳗弧菌为研究对象，对菌株的生物学特性、全菌疫苗的制备、佐剂疫苗的免疫效果、弱溶血活疫苗的免疫效果初探进行分析。主要研究结果如下：
1．鳗弧菌与美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的生物学特性研究
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种与鳗弧菌无宿主特异性，本实验对不同来源的24株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行溶血力检测，筛选一株最强溶血作为疫苗的开发菌株。分别对两株致病菌进行菌株的复壮与鉴定、OD600值与菌落数系、生长曲线和菌株致病力测定进行分析。结果表明：24株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种仅有两株最强溶血，分别为PDD1605和PDD1600，选用PDD1605(PDD)菌株制备灭活疫苗。PDD1605(PDD)与鳗弧菌(Vad)在OD600值0.2~0.8之间适用，线性公式为：PDD：Y=0.6518X-0.0158(Y:1×109CFU/mlX:OD600)Vad：Y=1.6315X-0.0213(Y:1×109CFU/mlX:OD600)两株菌的生长曲线结果显示PDD与Vad分别在第12h和24h进入稳定期；半至死浓度(LD50)结果为PDD：712CFU/g；Vad：624CFU/g。通过本实验为接下来疫苗的制备提供了数据参考。
2.皮肤溃疡症全菌疫苗的制备与保护效果研究
采用液体培养的方式，用终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，0.5%的甲醛对PDD和Vad进行灭活制备成单苗和二联疫苗，并对疫苗的安全性和免疫最佳疫苗浓度的筛选进行研究。结果显示：以109CFU/ml为灭活菌液浓度，PDD在添加终浓度为0.2%的甲醛溶液，28℃180r/min培养48h即可灭活完全；Vad在添加终浓度为0.2%的甲醛溶液，36h即可灭活完全；以PDD∶Vad=1∶1的配比制备二联疫苗(各疫苗浓度与单苗浓度相同)。以106~1010CFU/ml的疫苗浓度免疫许氏平鲉，结果显示，PDD免疫保护率(RPS)分别为23%、37%、40%、46%、90%；PDD-VadRPS为0%、30%、37%、40%、76%；VadRPS为55%、80%、96%、100%、100%；Vad-PDD组RPS为30%、93%、100%、100%、100%。结果表明，疫苗的免疫效果与浓度成正比，且在二联疫苗中PDD对Vad有一定的协同作用，Vad对PDD有一定的拮抗作用。
3.不同佐剂对疫苗的免疫效果研究
按比例制备佐剂疫苗FCA∶疫苗=1∶1、枸杞多糖(LBP)10mg/ml、M763∶疫苗=7∶3；肌肉注射许氏平鲉。在第4周、6周、8周和10周取脾肾测定T细胞介导的穿孔素(perforin-1-like)、B细胞受体CD22(B-cell receptor CD22)、巨噬细胞集落刺激因子受体样蛋白(macrophage-colony stimulating factor receptor-like protein)，免疫球蛋白Tau重链(IgT)等免疫相关基因的变化，并记录RPS。结果显示：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种单苗及其佐剂疫苗在四个时间点的免疫保护率为PDD：0%、17%、27%、10%；PDD-LBP:10%、86%、47%、40%；PDD-M763:70%、53%、30%、23%；PDD-FCA：80%、86%、50%、95%；美人鱼发光杆菌美人鱼亚种与鳗弧菌二联疫苗及其佐剂疫苗在四个时间点攻毒PDD的免疫保护率为PDD-Vad：0%、13%、43%、17%；PDD-Vad-LBP:46%、36%、23%、10%；PDD-Vad-M763：76%、57%、77%、30%；PDD-Vad-FCA：36%、57%、30%、95%；鳗弧菌单苗及其佐剂疫苗在四个时间点的免疫保护率为Vad：100%、100%、100%、100%；Vad-LBP：100%、100%、100%、100%；Vad-M763:100%、100%、100%、100%；Vad-FCA：100%、100%、100%、100%；美人鱼发光杆菌美人鱼亚种与鳗弧菌二联疫苗及其佐剂疫苗在四个时间点攻毒Vad的免疫保护率为Vad-PDD：100%、100%、100%、100%；Vad-PDD-LBP:100%、100%、96%、100%；Vad-PDD-M763：100%、100%、100%、100%；Vad-PDD-FCA：100%、100%、100%、100%。免疫基因结果显示不添加佐剂组与M763佐剂组均可引起四种基因的显著性变化，而LBP佐剂组与FCA佐剂组不能引起显著性变化。结果表明：佐剂的保护效果依次为FCA佐剂组＞M763佐剂组＞LBP佐剂组＞无佐剂组。免疫基因结果表明，基因的变化与对应的免疫保护率没有相关性，不添加佐剂组和M763佐剂组可长期激活基因的免疫通路，推测其致热源暴露过多或佐剂本身的副毒性较大引起的基因变化显著，可激活基因的通路，不能有效的诱导抗体的产生。综上上所述FCA佐剂是安全高效可靠的，可以作为佐剂疫苗的阳性对照，为以后佐剂疫苗的研制提供理论支持。
4.两株弱毒株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种活疫苗的免疫效果研究
本实验选取第一章美人鱼发光杆菌美人鱼亚种溶血力实验筛选的溶血力最弱的PDD0909和PDD0210两株弱毒株，研究其与强毒株的致病力差异分析，并以107CFU/ml作为弱溶血活疫苗，分别肌肉注射接种许氏平鲉，在第4周、6周、8周和10周取脾肾测定免疫相关基因的变化，并记录RPS。结果显示，弱溶血株仅有108CFU/mlPDD0210致病力为3.33%，108CFU/mlPDD0909的致病力为0%；免疫许氏平鲉后，两种弱溶血菌株相对疫苗组均可提高许氏平鲉对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的免疫保护效果，免疫效果RPS为，PDD：0%、17%、27%、10%；PDD0909：0%、23%、50%、23%；PDD0210：0%、30%、37%、7%；保护力的顺序为PDD0909＞PDD0210＞PDD。另外对四个免疫基因进行同期的转录水平检测，发现基因以PDD表达显著，PDD0909与PDD0210则表达水平低且变化不明显，说明了在4周到10周期间弱溶血菌株不能有效激活基因的免疫通路，且不会出现反毒现象。本实验对渔用弱溶血活疫苗的开发提供了一定的数据参考。
1．鳗弧菌与美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的生物学特性研究
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种与鳗弧菌无宿主特异性，本实验对不同来源的24株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种进行溶血力检测，筛选一株最强溶血作为疫苗的开发菌株。分别对两株致病菌进行菌株的复壮与鉴定、OD600值与菌落数系、生长曲线和菌株致病力测定进行分析。结果表明：24株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种仅有两株最强溶血，分别为PDD1605和PDD1600，选用PDD1605(PDD)菌株制备灭活疫苗。PDD1605(PDD)与鳗弧菌(Vad)在OD600值0.2~0.8之间适用，线性公式为：PDD：Y=0.6518X-0.0158(Y:1×109CFU/mlX:OD600)Vad：Y=1.6315X-0.0213(Y:1×109CFU/mlX:OD600)两株菌的生长曲线结果显示PDD与Vad分别在第12h和24h进入稳定期；半至死浓度(LD50)结果为PDD：712CFU/g；Vad：624CFU/g。通过本实验为接下来疫苗的制备提供了数据参考。
2.皮肤溃疡症全菌疫苗的制备与保护效果研究
采用液体培养的方式，用终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，0.5%的甲醛对PDD和Vad进行灭活制备成单苗和二联疫苗，并对疫苗的安全性和免疫最佳疫苗浓度的筛选进行研究。结果显示：以109CFU/ml为灭活菌液浓度，PDD在添加终浓度为0.2%的甲醛溶液，28℃180r/min培养48h即可灭活完全；Vad在添加终浓度为0.2%的甲醛溶液，36h即可灭活完全；以PDD∶Vad=1∶1的配比制备二联疫苗(各疫苗浓度与单苗浓度相同)。以106~1010CFU/ml的疫苗浓度免疫许氏平鲉，结果显示，PDD免疫保护率(RPS)分别为23%、37%、40%、46%、90%；PDD-VadRPS为0%、30%、37%、40%、76%；VadRPS为55%、80%、96%、100%、100%；Vad-PDD组RPS为30%、93%、100%、100%、100%。结果表明，疫苗的免疫效果与浓度成正比，且在二联疫苗中PDD对Vad有一定的协同作用，Vad对PDD有一定的拮抗作用。
3.不同佐剂对疫苗的免疫效果研究
按比例制备佐剂疫苗FCA∶疫苗=1∶1、枸杞多糖(LBP)10mg/ml、M763∶疫苗=7∶3；肌肉注射许氏平鲉。在第4周、6周、8周和10周取脾肾测定T细胞介导的穿孔素(perforin-1-like)、B细胞受体CD22(B-cell receptor CD22)、巨噬细胞集落刺激因子受体样蛋白(macrophage-colony stimulating factor receptor-like protein)，免疫球蛋白Tau重链(IgT)等免疫相关基因的变化，并记录RPS。结果显示：美人鱼发光杆菌美人鱼亚种单苗及其佐剂疫苗在四个时间点的免疫保护率为PDD：0%、17%、27%、10%；PDD-LBP:10%、86%、47%、40%；PDD-M763:70%、53%、30%、23%；PDD-FCA：80%、86%、50%、95%；美人鱼发光杆菌美人鱼亚种与鳗弧菌二联疫苗及其佐剂疫苗在四个时间点攻毒PDD的免疫保护率为PDD-Vad：0%、13%、43%、17%；PDD-Vad-LBP:46%、36%、23%、10%；PDD-Vad-M763：76%、57%、77%、30%；PDD-Vad-FCA：36%、57%、30%、95%；鳗弧菌单苗及其佐剂疫苗在四个时间点的免疫保护率为Vad：100%、100%、100%、100%；Vad-LBP：100%、100%、100%、100%；Vad-M763:100%、100%、100%、100%；Vad-FCA：100%、100%、100%、100%；美人鱼发光杆菌美人鱼亚种与鳗弧菌二联疫苗及其佐剂疫苗在四个时间点攻毒Vad的免疫保护率为Vad-PDD：100%、100%、100%、100%；Vad-PDD-LBP:100%、100%、96%、100%；Vad-PDD-M763：100%、100%、100%、100%；Vad-PDD-FCA：100%、100%、100%、100%。免疫基因结果显示不添加佐剂组与M763佐剂组均可引起四种基因的显著性变化，而LBP佐剂组与FCA佐剂组不能引起显著性变化。结果表明：佐剂的保护效果依次为FCA佐剂组＞M763佐剂组＞LBP佐剂组＞无佐剂组。免疫基因结果表明，基因的变化与对应的免疫保护率没有相关性，不添加佐剂组和M763佐剂组可长期激活基因的免疫通路，推测其致热源暴露过多或佐剂本身的副毒性较大引起的基因变化显著，可激活基因的通路，不能有效的诱导抗体的产生。综上上所述FCA佐剂是安全高效可靠的，可以作为佐剂疫苗的阳性对照，为以后佐剂疫苗的研制提供理论支持。
4.两株弱毒株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种活疫苗的免疫效果研究
本实验选取第一章美人鱼发光杆菌美人鱼亚种溶血力实验筛选的溶血力最弱的PDD0909和PDD0210两株弱毒株，研究其与强毒株的致病力差异分析，并以107CFU/ml作为弱溶血活疫苗，分别肌肉注射接种许氏平鲉，在第4周、6周、8周和10周取脾肾测定免疫相关基因的变化，并记录RPS。结果显示，弱溶血株仅有108CFU/mlPDD0210致病力为3.33%，108CFU/mlPDD0909的致病力为0%；免疫许氏平鲉后，两种弱溶血菌株相对疫苗组均可提高许氏平鲉对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的免疫保护效果，免疫效果RPS为，PDD：0%、17%、27%、10%；PDD0909：0%、23%、50%、23%；PDD0210：0%、30%、37%、7%；保护力的顺序为PDD0909＞PDD0210＞PDD。另外对四个免疫基因进行同期的转录水平检测，发现基因以PDD表达显著，PDD0909与PDD0210则表达水平低且变化不明显，说明了在4周到10周期间弱溶血菌株不能有效激活基因的免疫通路，且不会出现反毒现象。本实验对渔用弱溶血活疫苗的开发提供了一定的数据参考。