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研究背景
骨质疏松症是以低骨量和骨微细结构破坏为特征，导致骨脆性增加及易发生骨折的一种全身代谢性骨骼疾病[1-3]。随着老龄化社会的到来和人们对生活质量要求的提高，骨质疏松症已经成为严重影响老年人健康生活的一种常见疾病[4-6]。
原发性骨质疏松特点为增龄性，有别于继发性骨质疏松[7,8]。防治原发性骨质疏松主要是需要保持“骨稳态”，有文献报道参与“骨稳态”主要在于“二元学说”的成骨细胞与破骨细胞之间的平衡[9,10]。但又有研究发现，既往的“二元学说”已经不能完全解释骨重建与骨修复，提出了最新的“三元调控”理论，加入了血管形成促进骨质修复的学说，也就是“成骨细胞-破骨细胞-血管新生”理论，创新性地提供了防治骨质疏松的思路与途径[11-13]。而对于原发性骨质疏松，其成骨细胞活性下降甚至处于低弱状态，骨形成微弱甚至受限，单纯使用促进成骨细胞活性的药物进行防治原发性骨质疏松的效果不佳[14,15]。而破骨细胞活性却是十分活跃，其分化和骨吸收能力占为主导，导致骨量丢失，引起原发性骨质疏松[16]。另外，骨骼的新生离不开营养物质、氧气等，而血液能运输氧气、营养物质和废物等，血液运行于血管内，所以骨骼的生长离不开血管的新生。细胞阳性骨特异性碱性磷酸酶和细胞阳性骨钙素在外周血循环当中被检测到，并通过血液循环运输到骨组织中，参与骨形成[17]。因此，对于原发性骨质疏松的防治，可以针对性地着眼于破骨细胞与血管，通过抑制破骨细胞的分化和促进血管的新生达到防治原发性骨质疏松的效果[13,17,18]。
破骨细胞是一种多核细胞，核形体较为巨大，起源于单核巨噬细胞／单核系造血前体细胞，破骨细胞成熟后便转移到骨小梁和骨皮质内表面[19,20]。转录因子NF-κB受体活化因子配体(RANKL)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子家族(TNF)在破骨细胞前体细胞分化、活化过程中起至关重要作用[21,22]。RANKL与破骨细胞前体细胞上的RANK结合后，促进其分化、增殖、多核化及骨吸收功能[23,24]。下游导致原发性骨质疏松的破骨细胞相关信号通路包括MAPK,，NF-κB，钙离子等，进一步激活破骨细胞生成相关基因和蛋白的表达[25-28]。近年来，血管形成与骨形成之间的偶联关系成为骨质疏松治疗的新突破点[29]。间质干细胞不断地向骨祖细胞分化是正常骨形成的首要条件，从而分化为成骨细胞，促进骨形成，维持“骨稳态”；有研究表明血管内皮细胞的新生一方面有利于促进成骨细胞的分化，另外可以减弱破骨细胞分化成熟[30]，这对保证新骨形成、骨质的再生修复必不可少，而整个过程需要血管参与[29,31]。
补气通络方(BQTL)是由补阳还五汤加减化裁而来，为广州中医药大学第一附属医院特色方剂，方中主要由人参、黄芪、当归、川芎、丹参等药物组成，具有“活血通络、瘀去新生和活血生新”的作用。补气通络方对防治原发性骨质疏松尚未有相关报道，而且针对性地着眼于破骨细胞/血管新生双向一体的探讨补气通络方防治原发性骨质疏松的机制性研究，可以为临床用药提供充分的理论依据，更可以为进一下步开发相关防治原发性骨质疏松靶点药物打下坚实的研究基础。
我的研究设计分为以下5个部分：
第一部分补气通络方对体外破骨细胞分化和功能的影响
目的：
探讨补气通络方对体外RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收的影响。
方法：
从6-8周SPF级C57BL/6小鼠长骨内提取骨髓单核细胞(BMMs),在RANKL和M-CSF的共同刺激下，进行破骨细胞分化实验；使用MTS检测，验证补气通络方对BMMs的活性影响；设计时间进程干预实验(Time-course)明确补气通络方溶液究竟是在哪个关键时机点对BMMs产生影响；借助免疫荧光实验观察补气通络方溶液对破骨细胞上的F-actin环和PodosomeBelt的作用；应用羟基磷灰石涂层骨吸收实验验证补气通络方抑制破骨细胞骨吸收功能的效果。
结果：
1.补气通络方抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化，具有浓度依赖性。
2.MTS检测发现，补气通络方对BMMs没有毒性作用，不影响细胞活性。
3.Time-course实验发现，补气通络方可以在破骨细胞分化的全程发挥抑制作用，但是主要发挥抑制破骨细胞分化的作用集中在破骨细胞分化的早期阶段。
4.补气通络方能够有效地抑制由RANKL诱导的体外破骨细胞上F-actin环和PodosomeBelt的形成。
5.补气通络方可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞的骨吸收功能。
结论：
补气通络方呈浓度依赖性地在不影响BMMs的活性下，明显抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化及骨吸收功能，主要抑制作用集中在破骨细胞分化的早期阶段。
第二部分补气通络方对体外破骨细胞分化和功能影响的机制性研究
目的：
明确补气通络方对体外RANKL诱导的破骨细胞分化和功能影响的机制。
方法：
从6-8周SPF级C57BL/6小鼠长骨内提取骨髓单核细胞(BMMs),在RANKL和M-CSF的共同刺激下诱导破骨细胞，借助qRT-PCR检测破骨细胞相关特异性基因的表达；使用Westernblot(WB)法检测补气通络方溶液对RANKL诱导的破骨细胞相关蛋白以及MAPK、NF-κB信号通路相关重要蛋白磷酸化水平的影响；通过荧光素酶检测实验分别检测NFATc1及NF-κB活性以明确MAPK、及NF-κB信号通路情况；借助Ca2+震荡实验来研究补气通络方通过影响Ca2+信号而发挥抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能的作用。
结果：
1.qRT-PCR检测发现补气通络方能够明显地下调RANKL诱导的C-Fos、NFATc1、CTSK及Acp5等破骨细胞特异性基因的水平。
2.WB结果显示补气通络方能够明显抑制RANKL诱导的C-Fos、NFATc1、V-ATPase-d2(D2)、CTSK、及Integrinβ3等破骨相关蛋白的表达。
3.荧光素酶实验发现补气通络方明显地抑制了由RANKL诱导的破骨细胞上相关的NFATc1和NF-κB荧光素酶活性。
4.WB结果显示补气通络方抑制RANKL诱导的破骨细胞内MAPK和NF-κB信号通路相关重要蛋白的磷酸化水平。
5.从Ca2+震荡实验发现，补气通络方能够下调RANKL诱导的破骨细胞上Ca2+信号的活性和强度。
结论：
补气通络方抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能主要通过抑制MAPK、NF-κB和Ca2+信号通路完成。
第三部分补气通络方对卵巢切除所致的骨质疏松的影响
目的：
观察补气通络方对卵巢切除大鼠所致的骨质疏松的改善情况。
方法：
选取12周SD老龄大鼠，构建切除双侧卵巢的大鼠骨质疏松模型，随后药物干预6周，取材并对样本的股骨进行Micro-CT扫面及三维重建分析；然后，对样本的股骨进行病理组织学切片、HE染色和TRAcP染色。
结果：
1.Micro-CT分析发现，与OVX组对比，补气通络方组可以明显提高骨小梁的密度和数量，连续性强，定量分析上BV/TV和Tb.N在明显升高，Tb.Sp下降。
2.HE染色和TRAcP染色结果显示，与OVX组比较，补气通络方组骨小梁数目明显增多，而且骨小梁连续性变好，BV/TV明显高于OVX阳性对照组。补气通络方组上基本没有破骨细胞的深棕色染色，N.Oc/BS和Oc.S/BS分别明显低于OVX阳性对照组。结论：
补气通络方有效防治OVX大鼠体内破骨细胞活化后对骨质产生的骨溶解作用，改善骨质疏松。
第四部分补气通络方对体外血管内皮细胞的影响
目的：
明确补气通络方对血管内皮细胞的作用，验证补气通络方是否促进血管的再生。方法：
体外培养猪脐静脉内皮细胞(SUVECs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体系，运用MTS法分别检测补气通络方对SUVECs及HUVECs的增殖影响；应用细胞划痕迁移实验，分别观察补气通络方对SUVECs及HUVECs的迁移作用；使用Matrigel作为基底膜，验证补气通络方对HUVECs形成管腔样结构的影响。
结果：
1.补气通络方促进SUVECs、HUVECs细胞的增殖。
2.补气通络方促进SUVECs、HUVECs细胞的迁移。
3.补气通络方促进HUVECs细胞形成管腔样的结构。
结论：
补气通络方在体外通过促进SUVECs、HUVECs细胞的增殖和迁移，并进一步促进HUVECs细胞形成管腔结构，促进血管新生。
第五部分补气通络方对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生效应的影响
目的：
探讨补气通络方对鸡胚绒毛尿囊膜体内血管新生的影响。
方法：
选择受精3-4天的鸡胚，构建鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM)，创新性地加入一种生物材料-明胶海绵。补气通络方干预后取材并使用显微体视镜观察由CAM长入明胶海绵内部的血管情况；运用病理学HE染色和Masson染色分析明胶海绵血管内部结构；借助免疫荧光检测明胶海绵内部的血管上CD31和VEGF血管形成相关指标，明确补气通络方对CAM在体成血管的效应。
结果：
1.显微体视镜下发现，补气通络方刺激后，CAM上的生物材料明胶海绵内，血管数量较多，血管面积较大，脉络十分清晰，分级上血管的一级、二级和微小血管十分明显，分支没有发生断裂，血管密度高，结构十分清晰，形成网络密集血管网包裹着生物材料。
2.HE染色和Masson染色结果发现，补气通络方组形成较多的血管管腔，结构清晰完整，网络样形成及排列有序，红染的肌纤维较多，血管数量多而且面积较大。
3.从免疫荧光上，补气通络方组可以增强由CAM长入生物材料内部血管的CD31和VEGF荧光强度。
结论：
补气通络方明显有效地促进CAM在体内的血管新生。
骨质疏松症是以低骨量和骨微细结构破坏为特征，导致骨脆性增加及易发生骨折的一种全身代谢性骨骼疾病[1-3]。随着老龄化社会的到来和人们对生活质量要求的提高，骨质疏松症已经成为严重影响老年人健康生活的一种常见疾病[4-6]。
原发性骨质疏松特点为增龄性，有别于继发性骨质疏松[7,8]。防治原发性骨质疏松主要是需要保持“骨稳态”，有文献报道参与“骨稳态”主要在于“二元学说”的成骨细胞与破骨细胞之间的平衡[9,10]。但又有研究发现，既往的“二元学说”已经不能完全解释骨重建与骨修复，提出了最新的“三元调控”理论，加入了血管形成促进骨质修复的学说，也就是“成骨细胞-破骨细胞-血管新生”理论，创新性地提供了防治骨质疏松的思路与途径[11-13]。而对于原发性骨质疏松，其成骨细胞活性下降甚至处于低弱状态，骨形成微弱甚至受限，单纯使用促进成骨细胞活性的药物进行防治原发性骨质疏松的效果不佳[14,15]。而破骨细胞活性却是十分活跃，其分化和骨吸收能力占为主导，导致骨量丢失，引起原发性骨质疏松[16]。另外，骨骼的新生离不开营养物质、氧气等，而血液能运输氧气、营养物质和废物等，血液运行于血管内，所以骨骼的生长离不开血管的新生。细胞阳性骨特异性碱性磷酸酶和细胞阳性骨钙素在外周血循环当中被检测到，并通过血液循环运输到骨组织中，参与骨形成[17]。因此，对于原发性骨质疏松的防治，可以针对性地着眼于破骨细胞与血管，通过抑制破骨细胞的分化和促进血管的新生达到防治原发性骨质疏松的效果[13,17,18]。
破骨细胞是一种多核细胞，核形体较为巨大，起源于单核巨噬细胞／单核系造血前体细胞，破骨细胞成熟后便转移到骨小梁和骨皮质内表面[19,20]。转录因子NF-κB受体活化因子配体(RANKL)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和肿瘤坏死因子家族(TNF)在破骨细胞前体细胞分化、活化过程中起至关重要作用[21,22]。RANKL与破骨细胞前体细胞上的RANK结合后，促进其分化、增殖、多核化及骨吸收功能[23,24]。下游导致原发性骨质疏松的破骨细胞相关信号通路包括MAPK,，NF-κB，钙离子等，进一步激活破骨细胞生成相关基因和蛋白的表达[25-28]。近年来，血管形成与骨形成之间的偶联关系成为骨质疏松治疗的新突破点[29]。间质干细胞不断地向骨祖细胞分化是正常骨形成的首要条件，从而分化为成骨细胞，促进骨形成，维持“骨稳态”；有研究表明血管内皮细胞的新生一方面有利于促进成骨细胞的分化，另外可以减弱破骨细胞分化成熟[30]，这对保证新骨形成、骨质的再生修复必不可少，而整个过程需要血管参与[29,31]。
补气通络方(BQTL)是由补阳还五汤加减化裁而来，为广州中医药大学第一附属医院特色方剂，方中主要由人参、黄芪、当归、川芎、丹参等药物组成，具有“活血通络、瘀去新生和活血生新”的作用。补气通络方对防治原发性骨质疏松尚未有相关报道，而且针对性地着眼于破骨细胞/血管新生双向一体的探讨补气通络方防治原发性骨质疏松的机制性研究，可以为临床用药提供充分的理论依据，更可以为进一下步开发相关防治原发性骨质疏松靶点药物打下坚实的研究基础。
我的研究设计分为以下5个部分：
第一部分补气通络方对体外破骨细胞分化和功能的影响
目的：
探讨补气通络方对体外RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收的影响。
方法：
从6-8周SPF级C57BL/6小鼠长骨内提取骨髓单核细胞(BMMs),在RANKL和M-CSF的共同刺激下，进行破骨细胞分化实验；使用MTS检测，验证补气通络方对BMMs的活性影响；设计时间进程干预实验(Time-course)明确补气通络方溶液究竟是在哪个关键时机点对BMMs产生影响；借助免疫荧光实验观察补气通络方溶液对破骨细胞上的F-actin环和PodosomeBelt的作用；应用羟基磷灰石涂层骨吸收实验验证补气通络方抑制破骨细胞骨吸收功能的效果。
结果：
1.补气通络方抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化，具有浓度依赖性。
2.MTS检测发现，补气通络方对BMMs没有毒性作用，不影响细胞活性。
3.Time-course实验发现，补气通络方可以在破骨细胞分化的全程发挥抑制作用，但是主要发挥抑制破骨细胞分化的作用集中在破骨细胞分化的早期阶段。
4.补气通络方能够有效地抑制由RANKL诱导的体外破骨细胞上F-actin环和PodosomeBelt的形成。
5.补气通络方可以抑制由RANKL诱导的破骨细胞的骨吸收功能。
结论：
补气通络方呈浓度依赖性地在不影响BMMs的活性下，明显抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化及骨吸收功能，主要抑制作用集中在破骨细胞分化的早期阶段。
第二部分补气通络方对体外破骨细胞分化和功能影响的机制性研究
目的：
明确补气通络方对体外RANKL诱导的破骨细胞分化和功能影响的机制。
方法：
从6-8周SPF级C57BL/6小鼠长骨内提取骨髓单核细胞(BMMs),在RANKL和M-CSF的共同刺激下诱导破骨细胞，借助qRT-PCR检测破骨细胞相关特异性基因的表达；使用Westernblot(WB)法检测补气通络方溶液对RANKL诱导的破骨细胞相关蛋白以及MAPK、NF-κB信号通路相关重要蛋白磷酸化水平的影响；通过荧光素酶检测实验分别检测NFATc1及NF-κB活性以明确MAPK、及NF-κB信号通路情况；借助Ca2+震荡实验来研究补气通络方通过影响Ca2+信号而发挥抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能的作用。
结果：
1.qRT-PCR检测发现补气通络方能够明显地下调RANKL诱导的C-Fos、NFATc1、CTSK及Acp5等破骨细胞特异性基因的水平。
2.WB结果显示补气通络方能够明显抑制RANKL诱导的C-Fos、NFATc1、V-ATPase-d2(D2)、CTSK、及Integrinβ3等破骨相关蛋白的表达。
3.荧光素酶实验发现补气通络方明显地抑制了由RANKL诱导的破骨细胞上相关的NFATc1和NF-κB荧光素酶活性。
4.WB结果显示补气通络方抑制RANKL诱导的破骨细胞内MAPK和NF-κB信号通路相关重要蛋白的磷酸化水平。
5.从Ca2+震荡实验发现，补气通络方能够下调RANKL诱导的破骨细胞上Ca2+信号的活性和强度。
结论：
补气通络方抑制由RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能主要通过抑制MAPK、NF-κB和Ca2+信号通路完成。
第三部分补气通络方对卵巢切除所致的骨质疏松的影响
目的：
观察补气通络方对卵巢切除大鼠所致的骨质疏松的改善情况。
方法：
选取12周SD老龄大鼠，构建切除双侧卵巢的大鼠骨质疏松模型，随后药物干预6周，取材并对样本的股骨进行Micro-CT扫面及三维重建分析；然后，对样本的股骨进行病理组织学切片、HE染色和TRAcP染色。
结果：
1.Micro-CT分析发现，与OVX组对比，补气通络方组可以明显提高骨小梁的密度和数量，连续性强，定量分析上BV/TV和Tb.N在明显升高，Tb.Sp下降。
2.HE染色和TRAcP染色结果显示，与OVX组比较，补气通络方组骨小梁数目明显增多，而且骨小梁连续性变好，BV/TV明显高于OVX阳性对照组。补气通络方组上基本没有破骨细胞的深棕色染色，N.Oc/BS和Oc.S/BS分别明显低于OVX阳性对照组。结论：
补气通络方有效防治OVX大鼠体内破骨细胞活化后对骨质产生的骨溶解作用，改善骨质疏松。
第四部分补气通络方对体外血管内皮细胞的影响
目的：
明确补气通络方对血管内皮细胞的作用，验证补气通络方是否促进血管的再生。方法：
体外培养猪脐静脉内皮细胞(SUVECs)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体系，运用MTS法分别检测补气通络方对SUVECs及HUVECs的增殖影响；应用细胞划痕迁移实验，分别观察补气通络方对SUVECs及HUVECs的迁移作用；使用Matrigel作为基底膜，验证补气通络方对HUVECs形成管腔样结构的影响。
结果：
1.补气通络方促进SUVECs、HUVECs细胞的增殖。
2.补气通络方促进SUVECs、HUVECs细胞的迁移。
3.补气通络方促进HUVECs细胞形成管腔样的结构。
结论：
补气通络方在体外通过促进SUVECs、HUVECs细胞的增殖和迁移，并进一步促进HUVECs细胞形成管腔结构，促进血管新生。
第五部分补气通络方对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生效应的影响
目的：
探讨补气通络方对鸡胚绒毛尿囊膜体内血管新生的影响。
方法：
选择受精3-4天的鸡胚，构建鸡胚绒毛尿囊膜模型(CAM)，创新性地加入一种生物材料-明胶海绵。补气通络方干预后取材并使用显微体视镜观察由CAM长入明胶海绵内部的血管情况；运用病理学HE染色和Masson染色分析明胶海绵血管内部结构；借助免疫荧光检测明胶海绵内部的血管上CD31和VEGF血管形成相关指标，明确补气通络方对CAM在体成血管的效应。
结果：
1.显微体视镜下发现，补气通络方刺激后，CAM上的生物材料明胶海绵内，血管数量较多，血管面积较大，脉络十分清晰，分级上血管的一级、二级和微小血管十分明显，分支没有发生断裂，血管密度高，结构十分清晰，形成网络密集血管网包裹着生物材料。
2.HE染色和Masson染色结果发现，补气通络方组形成较多的血管管腔，结构清晰完整，网络样形成及排列有序，红染的肌纤维较多，血管数量多而且面积较大。
3.从免疫荧光上，补气通络方组可以增强由CAM长入生物材料内部血管的CD31和VEGF荧光强度。
结论：
补气通络方明显有效地促进CAM在体内的血管新生。