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肉碱是几乎存在于所有生物有机体中的一类具有活性的维生素(又名VBt)，它是现代养殖业常用且必要的饲料添加剂，是生命有机体中不可缺少的小分子代谢物质。动物体内肉碱的来源包括内源性合成和外源性的饲料摄入。大多数动物均可以自身合成肉碱，但在哺乳动物的研究中表明，幼龄动物合成肉碱的能力较弱，其合成水平不能满足需要，而关于肉碱内源合成不足的影响因素主要集中在三甲基赖氨酸双加氧酶(Trimethyllysine Dioxygenase，TMLD)、γ-丁甜菜碱双加氧酶(γ-ButyrobetaineDioxygenase，BBD)和过氧化物酶体增殖物激活受体α(ProxisomeProliferatorActivatedReceptorα，PPARα)等。那么在鱼类早期发育中是否也存在肉碱合成能力低(或没有肉碱合成能力)这一问题？目前还没有明确的答案，另外，鱼类早期发育中肉碱内源合成与主要调控因子的关系也尚不清晰。因此，本研究以斑马鱼为对象，在微量肉碱饵料投喂下，分别从代谢水平、转录水平及蛋白水平监测斑马鱼早期发育中肉碱内源合成的关键调控因子(TMLD、BBD和PPARα等)的动态变化，并通过相关性分析，探究斑马鱼早期发育中肉碱内源合成与关键调控因子的相关性，获得了以下结果：
(1)斑马鱼早期发育中肉碱含量与生长的关系分析。斑马鱼体内的肉碱含量反应其肉碱内源合成能力，而游离肉碱是肉碱的主要形式，通过测定斑马鱼早期发育中体内游离肉碱的含量，发现幼龄斑马鱼具有合成肉碱的能力。在斑马鱼早期发育中(7-84 d)，其全鱼游离肉碱含量的变化趋势是先下降后升高，其中，在35d时全鱼游离肉碱含量最低，35d后全鱼游离肉碱水平逐渐升高，尤其在56-84d时游离肉碱含量极显著升高(p＜0.001)。选取斑马鱼体内游离肉碱含量呈极显著变化的发育阶段(56-84 d)，测定斑马鱼各组织(肝胰腺、肾脏、脑和肌肉)中的游离肉碱含量，发现各组织中游离肉碱含量均逐渐升高，在84d时肝胰腺、肾脏和脑中游离肉碱含量显著升高(p＜0.05)，比70d时游离肉碱含量高出2倍左右，84d可能是斑马鱼肉碱合成的重要时期；与其它组织相比，56-84d中均是肝胰腺的游离肉碱含量最高且差异极显著(p＜0.001)，其次是肾脏、肌肉，而脑中游离肉碱含量最低，肝胰腺是斑马鱼肉碱内源合成的重要组织。
(2)斑马鱼早期发育中脂肪酸和氨基酸组成的变化。斑马鱼早期发育中(56-84 d)，∑n-6PUFA、∑n-3PUFA和∑PUFA显著增加(p＜0.01)，而∑SFA极显著降低(p＜0.001)；鱼体反油酸(C18：1n9t)和棕榈酸(C16：0)的水平显著降低(p＜0.01)；体内亚油酸(C18：2n6c)，EPA(C20：5n3)和DHA (C22：6n3)的水平显著升高(p＜0.01)。早期发育中(56-84 d)，斑马鱼体内的氨基酸含量不断增加，其中作为肉碱合成底物的赖氨酸和蛋氨酸水平显著升高(p＜0.05)；支链氨基酸(Branched Chain Amino Acid，BCAA)显著增加(p＜0.05)；亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)水平显著增加(p＜0.05)。
(3)TMLD和BBD在斑马鱼早期发育中的表达分析。本研究通过RT-qPCR和WesternBlot技术对TMLD和BBD的表达进行检测。从基因表达中发现：在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，TMLD和BBD基因表达显著上调(p＜0.001)，而在84d时各组织中TMLD和BBD基因表达水平较低，84d可能是诱导肉碱生物合成的重要时期；56-84d中斑马鱼的肝胰腺、肾脏、脑和肌肉组织均有TMLD和BBD基因表达，但TMLD和BBD基因在肝胰腺和肾脏中高表达。从蛋白表达中发现：56-84d斑马鱼全鱼的TMLD和BBD蛋白表达整体呈上调趋势，各组织的BBD蛋白表达也呈上调趋势；56-84d在斑马鱼的肝胰腺、肾脏、脑和肌肉组织中均检测到TMLD和BBD蛋白表达，但主要在肝胰腺和肾脏中表达，肝胰腺和肾脏是TMLD和BBD表达的主要组织部位。
(4)PPARα在斑马鱼早期发育中的表达分析。从基因表达中发现：在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，肝胰腺、肾脏和脑中PPARα基因表达上调，在84d时PPARα基因表达水平最高，其中，在84d时肝胰腺和脑组织中PPARα基因表达水平比56d时高出约2-3倍(P＜0.001)；在84d时肾脏中PPARα基因表达水平比56d时高出约6倍(P＜0.001)。56-84d，在斑马鱼肝胰腺、肾脏、脑和肌肉中均检测到PPARα基因表达，但在56-84d中均显示肝胰腺中PPARα基因表达显著高于其它组织(p＜0.001)，其次是肾脏，而脑和肌肉中PPARα基因表达水平较低。从蛋白表达中发现：在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，其全鱼PPARα蛋白表达整体呈上调趋势，且各组织(肝胰腺、肾脏、脑和肌肉)中PPARα蛋白表达水平显著上调(p＜0.001)，84d时各组织中PPARα蛋白表达水平约是56d时PPARα蛋白表达水平的5-6倍(P＜0.001)，84d可能是通过PPARα调节肉碱合成的关键时期；在斑马鱼的肝胰腺、肾脏、脑和肌肉中均检测到PPARα蛋白表达，但在肝胰腺中PPARα蛋白表达水平最高，肝胰腺是PPARα表达的主要组织部位。
(5)斑马鱼早期发育中肉碱内源合成与关键因子的相关性分析。在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，斑马鱼体内肉碱含量与生长呈极显著正相关。斑马鱼体内肉碱含量与BBD和PPARα呈显著正相关(p＜0.05)，其中与PPARα呈极显著正相关(p＜0.01)，但与TMLD呈负相关。斑马鱼体内肉碱合成与∑SFA呈极显著负相关(p＜0.01)，与∑n-3PUFA、∑n-6PUFA和∑PUFA均呈极显著正相关(p＜0.01)。斑马鱼体内肉碱内源合成与氨基酸呈正相关，其中与肉碱合成底物赖氨酸和蛋氨酸均呈显著正相关(p＜0.05)；与BCAA呈正相关；与Leu，Ile和Val呈极显著正相关(p＜0.01)。
综上所述，斑马鱼早期发育中具有肉碱合成能力。在斑马鱼早期发育中，其肉碱内源合成与氨基酸和PUFA之间具有正相关性，与关键因子BBD和PPARα之间具有显著正相关性，而与TMLD之间具有负相关性。为进一步研究肉碱内源合成机制奠定理论基础，为通过诱导肉碱内源合成来补充肉碱的研究提供理论依据。
(1)斑马鱼早期发育中肉碱含量与生长的关系分析。斑马鱼体内的肉碱含量反应其肉碱内源合成能力，而游离肉碱是肉碱的主要形式，通过测定斑马鱼早期发育中体内游离肉碱的含量，发现幼龄斑马鱼具有合成肉碱的能力。在斑马鱼早期发育中(7-84 d)，其全鱼游离肉碱含量的变化趋势是先下降后升高，其中，在35d时全鱼游离肉碱含量最低，35d后全鱼游离肉碱水平逐渐升高，尤其在56-84d时游离肉碱含量极显著升高(p＜0.001)。选取斑马鱼体内游离肉碱含量呈极显著变化的发育阶段(56-84 d)，测定斑马鱼各组织(肝胰腺、肾脏、脑和肌肉)中的游离肉碱含量，发现各组织中游离肉碱含量均逐渐升高，在84d时肝胰腺、肾脏和脑中游离肉碱含量显著升高(p＜0.05)，比70d时游离肉碱含量高出2倍左右，84d可能是斑马鱼肉碱合成的重要时期；与其它组织相比，56-84d中均是肝胰腺的游离肉碱含量最高且差异极显著(p＜0.001)，其次是肾脏、肌肉，而脑中游离肉碱含量最低，肝胰腺是斑马鱼肉碱内源合成的重要组织。
(2)斑马鱼早期发育中脂肪酸和氨基酸组成的变化。斑马鱼早期发育中(56-84 d)，∑n-6PUFA、∑n-3PUFA和∑PUFA显著增加(p＜0.01)，而∑SFA极显著降低(p＜0.001)；鱼体反油酸(C18：1n9t)和棕榈酸(C16：0)的水平显著降低(p＜0.01)；体内亚油酸(C18：2n6c)，EPA(C20：5n3)和DHA (C22：6n3)的水平显著升高(p＜0.01)。早期发育中(56-84 d)，斑马鱼体内的氨基酸含量不断增加，其中作为肉碱合成底物的赖氨酸和蛋氨酸水平显著升高(p＜0.05)；支链氨基酸(Branched Chain Amino Acid，BCAA)显著增加(p＜0.05)；亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)水平显著增加(p＜0.05)。
(3)TMLD和BBD在斑马鱼早期发育中的表达分析。本研究通过RT-qPCR和WesternBlot技术对TMLD和BBD的表达进行检测。从基因表达中发现：在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，TMLD和BBD基因表达显著上调(p＜0.001)，而在84d时各组织中TMLD和BBD基因表达水平较低，84d可能是诱导肉碱生物合成的重要时期；56-84d中斑马鱼的肝胰腺、肾脏、脑和肌肉组织均有TMLD和BBD基因表达，但TMLD和BBD基因在肝胰腺和肾脏中高表达。从蛋白表达中发现：56-84d斑马鱼全鱼的TMLD和BBD蛋白表达整体呈上调趋势，各组织的BBD蛋白表达也呈上调趋势；56-84d在斑马鱼的肝胰腺、肾脏、脑和肌肉组织中均检测到TMLD和BBD蛋白表达，但主要在肝胰腺和肾脏中表达，肝胰腺和肾脏是TMLD和BBD表达的主要组织部位。
(4)PPARα在斑马鱼早期发育中的表达分析。从基因表达中发现：在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，肝胰腺、肾脏和脑中PPARα基因表达上调，在84d时PPARα基因表达水平最高，其中，在84d时肝胰腺和脑组织中PPARα基因表达水平比56d时高出约2-3倍(P＜0.001)；在84d时肾脏中PPARα基因表达水平比56d时高出约6倍(P＜0.001)。56-84d，在斑马鱼肝胰腺、肾脏、脑和肌肉中均检测到PPARα基因表达，但在56-84d中均显示肝胰腺中PPARα基因表达显著高于其它组织(p＜0.001)，其次是肾脏，而脑和肌肉中PPARα基因表达水平较低。从蛋白表达中发现：在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，其全鱼PPARα蛋白表达整体呈上调趋势，且各组织(肝胰腺、肾脏、脑和肌肉)中PPARα蛋白表达水平显著上调(p＜0.001)，84d时各组织中PPARα蛋白表达水平约是56d时PPARα蛋白表达水平的5-6倍(P＜0.001)，84d可能是通过PPARα调节肉碱合成的关键时期；在斑马鱼的肝胰腺、肾脏、脑和肌肉中均检测到PPARα蛋白表达，但在肝胰腺中PPARα蛋白表达水平最高，肝胰腺是PPARα表达的主要组织部位。
(5)斑马鱼早期发育中肉碱内源合成与关键因子的相关性分析。在斑马鱼早期发育中(56-84 d)，斑马鱼体内肉碱含量与生长呈极显著正相关。斑马鱼体内肉碱含量与BBD和PPARα呈显著正相关(p＜0.05)，其中与PPARα呈极显著正相关(p＜0.01)，但与TMLD呈负相关。斑马鱼体内肉碱合成与∑SFA呈极显著负相关(p＜0.01)，与∑n-3PUFA、∑n-6PUFA和∑PUFA均呈极显著正相关(p＜0.01)。斑马鱼体内肉碱内源合成与氨基酸呈正相关，其中与肉碱合成底物赖氨酸和蛋氨酸均呈显著正相关(p＜0.05)；与BCAA呈正相关；与Leu，Ile和Val呈极显著正相关(p＜0.01)。
综上所述，斑马鱼早期发育中具有肉碱合成能力。在斑马鱼早期发育中，其肉碱内源合成与氨基酸和PUFA之间具有正相关性，与关键因子BBD和PPARα之间具有显著正相关性，而与TMLD之间具有负相关性。为进一步研究肉碱内源合成机制奠定理论基础，为通过诱导肉碱内源合成来补充肉碱的研究提供理论依据。