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家畜卵巢的排卵过程受到多种因素影响与调控。卵巢的排卵数决定着母畜的产仔数，而产仔数是反映母畜繁殖性能的重要指标之一。因此，探究山羊卵巢的卵泡发育调控机理对提高山羊的繁殖性能具有重要的理论与实践价值。本研究以陕北白绒山羊为研究对象，聚焦其卵巢卵泡发育调控过程，利用高通量测序、生物信息学分析、蛋白免疫印迹、细胞共培养、流式细胞分析等技术方法，筛选鉴定与山羊排卵密切相关的mRNA和miRNA，进而验证其功能作用。经过研究，获得的主要研究结果如下：
1.构建了发情期陕北白绒山羊优势卵泡及其从属卵泡的6个转录组文库和6个sRNA文库。转录组测序结果表明，优势卵泡和从属卵泡中共表达基因21177个，差异表达基因222个，其中上调基因166个，下调基因56个。对其中差异表达基因的GO和KEGG通路分析表明，这些差异表达基因主要参与类固醇激素的生物合成过程；利用miRNA测序结果分析，筛选到了差异表达miRNA12个(上调9个，下调3个)，其中经过分析鉴定认为关键的候选miRNA有4个，分别为chi-miR-196、chi-miR-451-5p、chi-miR-202-5p和chi-miR-144-5p；联合分析表明，候选miRNA及其靶基因主要参与卵巢类固醇的合成和卵母细胞减数分裂过程。
2.捕获了山羊卵泡外泌体，并对其功能进行了研究。利用梯度离心和超速离心相结合的方法成功获得陕北白绒山羊卵巢中卵泡液外泌体囊泡，采用蛋白免疫印迹、透射电镜分析以及粒径分析方法，证明该外泌体囊泡中确实含有外泌体；体外试验证明，DiI标记的外泌体能够被颗粒细胞和COCs的卵丘细胞摄取；通过分离不同发育阶段卵泡外泌体(小卵泡阶段，d＜3mm，SFF；大卵泡阶段，d＞5mm，LFF)，在与颗粒细胞和COCs共培养后，发现SFF-EVs能够促进颗粒细胞的增殖，SFF-EVs和LFF-EVs均有促进卵丘细胞扩展的作用。
3.从卵泡液中鉴定出与卵泡发育有关的关键外泌体miRNA并预测靶基因。利用sRNA-seq技术分析SFF-EVs和LFF-EVs中miRNA组分，鉴定出已知miRNA285个。经过表达量分析发现，高表达的miRNA中前23个分别占SFF-EVs和LFF-EVs中总miRNA表达量的96%和97%，其中差异表达miRNA共有14个(8个上调，6个下调)，其中chi-miR-202-5p差异表达最显著；进一步预测分析表明，这14个差异表达miRNA共涉及靶基因1968个，其主要参与轴突导向、FoxOpathway、MAPKpathway、PI3K-AKTpathway等信号通路。
4.研究证明chi-miR-202-5p主要调控山羊卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡。分析表明，chi-miR-202-5p不仅在大卵泡及其外泌体中显著富集，chi-miR-202-5p在山羊大卵泡颗粒细胞及卵丘细胞中也呈现高表达。流式细胞术和EdU增殖试验发现过表达chi-miR-202-5p能够抑制颗粒细胞增殖、诱导其凋亡，而抑制chi-miR-202-5p的表达，则能够促进颗粒细胞增殖、减少其凋亡。
5.研究分析了chi-miR-202-5p在山羊卵泡颗粒细胞中的作用机制。采用双荧光素酶报告检测方法，证明了chi-miR-202-5p与靶基因TGFβR2mRNA是在3’-UTR的三个靶位点上结合，以达到抑制基因表达的作用；过表达chi-miR-202-5p能够靶向抑制TGFβR2mRNA的表达、下调TGFβR2蛋白水平，进而可抑制其下游蛋白SMAD3的磷酸化水平，致使颗粒细胞凋亡。
6.研究明确了chi-miR-202-5p在山羊卵泡颗粒细胞中的表达途径。研究结果表明，在大卵泡颗粒细胞中转录因子SF1通过与pre-miR-202和CYP19A1基因启动子结合，促进了chi-miR-202-5p和CYP19A1的表达，进而，促进了卵泡颗粒细胞E2的分泌。同时，在卵泡颗粒细胞中，chi-miR-202-5p介导SF1参与调控TGF-β信号通路的新途径。
综上所述，本研究通过高通量测序等方法鉴定了陕北白绒山羊优势卵泡和从属卵泡中差异表达基因及miRNA，以及不同卵泡发育阶段卵泡液外泌体miRNA，并利用生物信息学方法筛选获得影响卵泡发育的关键基因和miRNA。系统分析验证了chi-miR-202-5p在卵巢卵泡颗粒细胞中的调控作用及其作用途径，为阐明山羊卵泡发育过程提供了分子生物学基础。
1.构建了发情期陕北白绒山羊优势卵泡及其从属卵泡的6个转录组文库和6个sRNA文库。转录组测序结果表明，优势卵泡和从属卵泡中共表达基因21177个，差异表达基因222个，其中上调基因166个，下调基因56个。对其中差异表达基因的GO和KEGG通路分析表明，这些差异表达基因主要参与类固醇激素的生物合成过程；利用miRNA测序结果分析，筛选到了差异表达miRNA12个(上调9个，下调3个)，其中经过分析鉴定认为关键的候选miRNA有4个，分别为chi-miR-196、chi-miR-451-5p、chi-miR-202-5p和chi-miR-144-5p；联合分析表明，候选miRNA及其靶基因主要参与卵巢类固醇的合成和卵母细胞减数分裂过程。
2.捕获了山羊卵泡外泌体，并对其功能进行了研究。利用梯度离心和超速离心相结合的方法成功获得陕北白绒山羊卵巢中卵泡液外泌体囊泡，采用蛋白免疫印迹、透射电镜分析以及粒径分析方法，证明该外泌体囊泡中确实含有外泌体；体外试验证明，DiI标记的外泌体能够被颗粒细胞和COCs的卵丘细胞摄取；通过分离不同发育阶段卵泡外泌体(小卵泡阶段，d＜3mm，SFF；大卵泡阶段，d＞5mm，LFF)，在与颗粒细胞和COCs共培养后，发现SFF-EVs能够促进颗粒细胞的增殖，SFF-EVs和LFF-EVs均有促进卵丘细胞扩展的作用。
3.从卵泡液中鉴定出与卵泡发育有关的关键外泌体miRNA并预测靶基因。利用sRNA-seq技术分析SFF-EVs和LFF-EVs中miRNA组分，鉴定出已知miRNA285个。经过表达量分析发现，高表达的miRNA中前23个分别占SFF-EVs和LFF-EVs中总miRNA表达量的96%和97%，其中差异表达miRNA共有14个(8个上调，6个下调)，其中chi-miR-202-5p差异表达最显著；进一步预测分析表明，这14个差异表达miRNA共涉及靶基因1968个，其主要参与轴突导向、FoxOpathway、MAPKpathway、PI3K-AKTpathway等信号通路。
4.研究证明chi-miR-202-5p主要调控山羊卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡。分析表明，chi-miR-202-5p不仅在大卵泡及其外泌体中显著富集，chi-miR-202-5p在山羊大卵泡颗粒细胞及卵丘细胞中也呈现高表达。流式细胞术和EdU增殖试验发现过表达chi-miR-202-5p能够抑制颗粒细胞增殖、诱导其凋亡，而抑制chi-miR-202-5p的表达，则能够促进颗粒细胞增殖、减少其凋亡。
5.研究分析了chi-miR-202-5p在山羊卵泡颗粒细胞中的作用机制。采用双荧光素酶报告检测方法，证明了chi-miR-202-5p与靶基因TGFβR2mRNA是在3’-UTR的三个靶位点上结合，以达到抑制基因表达的作用；过表达chi-miR-202-5p能够靶向抑制TGFβR2mRNA的表达、下调TGFβR2蛋白水平，进而可抑制其下游蛋白SMAD3的磷酸化水平，致使颗粒细胞凋亡。
6.研究明确了chi-miR-202-5p在山羊卵泡颗粒细胞中的表达途径。研究结果表明，在大卵泡颗粒细胞中转录因子SF1通过与pre-miR-202和CYP19A1基因启动子结合，促进了chi-miR-202-5p和CYP19A1的表达，进而，促进了卵泡颗粒细胞E2的分泌。同时，在卵泡颗粒细胞中，chi-miR-202-5p介导SF1参与调控TGF-β信号通路的新途径。
综上所述，本研究通过高通量测序等方法鉴定了陕北白绒山羊优势卵泡和从属卵泡中差异表达基因及miRNA，以及不同卵泡发育阶段卵泡液外泌体miRNA，并利用生物信息学方法筛选获得影响卵泡发育的关键基因和miRNA。系统分析验证了chi-miR-202-5p在卵巢卵泡颗粒细胞中的调控作用及其作用途径，为阐明山羊卵泡发育过程提供了分子生物学基础。