论文部分内容阅读
马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid，PSTVd)是近几年影响马铃薯生产的重要病原之一，对马铃薯的产量和品质具有严重的影响，导致其品种的种性退化和品质下降。感染后马铃薯一般减产30%左右，严重时高达90%。PSTVd具有极高的侵染性，可通过农机具、切刀、种薯切块摩擦等方式进行汁液传播，也可通过介体昆虫、花粉、种子、块茎、水等方式传播。PSTVd能在马铃薯的任何生育时期进行侵染，并表现多种症状。
本研究以本实验室保存的带有PSTVd内蒙分离物的马铃薯组培苗为材料,通过RT-PCR获得PSTVd内蒙分离物的全长cDNA。在此基础上，分别构建了含有双T7、单T7的单倍和双倍全长原核体外转录表达侵染性克隆载体和基于农杆菌的体内表达侵染性克隆载体，为进一步研究PSTVd的生物学特性、致病机理、马铃薯抗PSTVd材料筛选、PSTVd与马铃薯的互作等奠定了基础。所取得的主要研究结果如下：
⒈构建了7个PSTVd的侵染性克隆载体。获得了PSTVd单倍全长基因组的cDNA(简称为P)和双倍全长片段(简称为2P)，分别将其克隆到载体pMD19-T中，获得pMD19-P和pMD19-2P，测序结果显示正确。在此基础上，分别构建了1个以pGEM-T为基础的靠T7或SP6能体外正反向转录单倍全长PSTVdRNA的侵染性克隆载体pGEM-P、2个以pGEM-T为基础的靠T7或SP6能体外正反向转录双倍全长PSTVdRNA的侵染性克隆载体pGEM-2P(SphⅠ-SacⅠ)和pGEM-2P(EcoRⅠ-SalⅠ)，2个以L4440为基础的靠双T7体外双向转录的侵染性克隆载体(L4440-P和L4440-2P)、2个以pROKII为基础的靠35S启动体内正反向转录植物表达载体pROKII-2P，并分别将其转入农杆菌LBA4404中，获得三个侵染性克隆K6、K19和K22。PSTVd侵染性克隆的构建，为PSTVd分子特征及生物学特性、致病机理、马铃薯抗PSTVd材料筛选、PSTVd与马铃薯的互作等研究奠定了基础。
⒉完成了8个原核表达PSTVd侵染性克隆的体外转录。分别应用T7和SP6RNA聚合酶分别对以3个pGEM-T为基础的构建侵染性克隆载体[pGEM-P、pGEM-2P(SphⅠ-SacⅠ)和pGEM-2P(EcoRⅠ-SalⅠ)]、2个以L4440为基础的构建侵染性克隆载体(L4440-P和L4440-2P)进行体外转录，分别获得2个单倍全长正向和反向的pSTVd单链RNA转录物、4个两倍全长的正向、反向pSTVd单链RNA转录物、1个单倍全长正反向pSTVddsRNA和1个两倍全长正反向pSTVddsRNA转录物。
3.完成了不同构建的PSTVd侵染性克隆侵染性检测。采用下部茎浸蘸法，将获得的8个体外转录物和3个农杆菌(K6、K19和K22)分别对健康的青薯9号(09-170t)马铃薯组培苗(带有芽尖剪取上端)侵染10min，20d后分别剪取上部茎尖提取植物总RNA，进行RT-PCR检测。结果表明仅有单倍反向的PSTVdRNA转录物(SP6RNA聚合酶以pGEM-P为模板的转录物)浸蘸的植株全部(5株)呈阴性，pGEM-2P(SphⅠ-SacⅠ)的T7转录物处理有3株阳性，2株阴性，而其他转录物及农杆菌浸蘸各处理，均100%呈阳性，阳性对照及健康植株均反应正常。
综上可见，所构建的PSTVd克隆化病毒载体除了SP6RNA聚合酶以pGEM-P为模板的转录物外，均具有侵染性，均可在植株体内检测到PSTVd的存在，说明所构建的PSTVd侵染性克隆均可用于该类病毒接种，这为该类病毒的接种，为该类病毒突变体的构建，致病机制的探索和致病特点的研究奠定了基础。
本研究以本实验室保存的带有PSTVd内蒙分离物的马铃薯组培苗为材料,通过RT-PCR获得PSTVd内蒙分离物的全长cDNA。在此基础上，分别构建了含有双T7、单T7的单倍和双倍全长原核体外转录表达侵染性克隆载体和基于农杆菌的体内表达侵染性克隆载体，为进一步研究PSTVd的生物学特性、致病机理、马铃薯抗PSTVd材料筛选、PSTVd与马铃薯的互作等奠定了基础。所取得的主要研究结果如下：
⒈构建了7个PSTVd的侵染性克隆载体。获得了PSTVd单倍全长基因组的cDNA(简称为P)和双倍全长片段(简称为2P)，分别将其克隆到载体pMD19-T中，获得pMD19-P和pMD19-2P，测序结果显示正确。在此基础上，分别构建了1个以pGEM-T为基础的靠T7或SP6能体外正反向转录单倍全长PSTVdRNA的侵染性克隆载体pGEM-P、2个以pGEM-T为基础的靠T7或SP6能体外正反向转录双倍全长PSTVdRNA的侵染性克隆载体pGEM-2P(SphⅠ-SacⅠ)和pGEM-2P(EcoRⅠ-SalⅠ)，2个以L4440为基础的靠双T7体外双向转录的侵染性克隆载体(L4440-P和L4440-2P)、2个以pROKII为基础的靠35S启动体内正反向转录植物表达载体pROKII-2P，并分别将其转入农杆菌LBA4404中，获得三个侵染性克隆K6、K19和K22。PSTVd侵染性克隆的构建，为PSTVd分子特征及生物学特性、致病机理、马铃薯抗PSTVd材料筛选、PSTVd与马铃薯的互作等研究奠定了基础。
⒉完成了8个原核表达PSTVd侵染性克隆的体外转录。分别应用T7和SP6RNA聚合酶分别对以3个pGEM-T为基础的构建侵染性克隆载体[pGEM-P、pGEM-2P(SphⅠ-SacⅠ)和pGEM-2P(EcoRⅠ-SalⅠ)]、2个以L4440为基础的构建侵染性克隆载体(L4440-P和L4440-2P)进行体外转录，分别获得2个单倍全长正向和反向的pSTVd单链RNA转录物、4个两倍全长的正向、反向pSTVd单链RNA转录物、1个单倍全长正反向pSTVddsRNA和1个两倍全长正反向pSTVddsRNA转录物。
3.完成了不同构建的PSTVd侵染性克隆侵染性检测。采用下部茎浸蘸法，将获得的8个体外转录物和3个农杆菌(K6、K19和K22)分别对健康的青薯9号(09-170t)马铃薯组培苗(带有芽尖剪取上端)侵染10min，20d后分别剪取上部茎尖提取植物总RNA，进行RT-PCR检测。结果表明仅有单倍反向的PSTVdRNA转录物(SP6RNA聚合酶以pGEM-P为模板的转录物)浸蘸的植株全部(5株)呈阴性，pGEM-2P(SphⅠ-SacⅠ)的T7转录物处理有3株阳性，2株阴性，而其他转录物及农杆菌浸蘸各处理，均100%呈阳性，阳性对照及健康植株均反应正常。
综上可见，所构建的PSTVd克隆化病毒载体除了SP6RNA聚合酶以pGEM-P为模板的转录物外，均具有侵染性，均可在植株体内检测到PSTVd的存在，说明所构建的PSTVd侵染性克隆均可用于该类病毒接种，这为该类病毒的接种，为该类病毒突变体的构建，致病机制的探索和致病特点的研究奠定了基础。