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卵巢是雌性动物的重要生殖器官。卵巢卵泡的生长、闭锁和排卵均会影响雌性动物的繁殖力。颗粒细胞影响卵泡命运，为卵泡生长和维持提供服务，并通过其凋亡过程介导卵泡闭锁，成为众多研究卵泡生长和闭锁机制的关注焦点。近年来越来越多的证据表明，kisspeptin不仅可通过下丘脑调节哺乳动物繁殖活动，而且可直接作用于卵巢，调节卵泡发育和排卵。MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码单链小分子RNA，已有研究表明，miRNA在颗粒细胞功能的调节中起着重要作用。本实验室前期发现，100nMkisspeptin-10(kp-10)无血清处理24h可抑制牛卵巢颗粒细胞凋亡。随后，对kp-10处理组和对照组进行了miRNA测序和转录组(RNA-Seq)关联分析以及双荧光素酶报告基因试验，发现miR-10b靶向抑制纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的表达。为明确kisspeptin通过miR-10b/PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用，我们开展了如下研究。
第一部分，miR-10b通过PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。首先，将牛卵巢颗粒细胞转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和mimicsNC，48h后，利用quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测mR-10b表达量，利用流式细胞术、qRT-PCR和westernblot研究miR-10b对牛颗粒细胞凋亡、凋亡相关基因及PAI-1表达的影响；随后，构建PAI-1过表达质粒(pcDNA3.1-PAI-1)，将牛卵巢颗粒细胞转染pcDNA3.1-PAI-1和pcDNA3.1，48h后，利用qRT-PCR检测PAI-1的表达量，利用流式细胞术、qRT-PCR和westernblot研究PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响；在此基础上，将miR-10bmimics与pcDNA3.1-PAI-1或pcDNA3.1共转染牛卵巢颗粒细胞48h，利用流式细胞术和qRT-PCR研究miR-10b通过PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。第二部分，kisspeptin通过miR-10b/PAI-1对牛卵巢颗粒细胞的作用。首先，将牛卵巢颗粒细胞转染miR-10bmimics和mimicsNC24h后，外源添加100nM的kp-10无血清处理24h，利用流式细胞术和qRT-PCR研究kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用与miR-10b的关系；随后，在牛卵巢颗粒细胞转染pcDNA3.1-PAI-1和pcDNA3.124h后，外源添加100nM的kp-10无血清处理24h，利用流式细胞术和qRT-PCR研究kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用与PAI-1的关系。
结果显示，miR-10b过表达组miR-10b表达量显著上升，提示转染成功。同时，过表达miR-10b可升高牛卵巢颗粒细胞凋亡率、降低Bcl-2/Bax表达比值、升高Caspase-3表达水平、降低PAI-1表达水平。PAI-1过表达组PAI-1表达量显著上升，提示转染成功。同时，过表达PAI-1可降低牛卵巢颗粒细胞凋亡率、升高Bcl-2/Bax表达比值、降低Caspase-3表达水平。此外，过表达PAI-1可抑制miR-10b诱导的凋亡、升高Bcl-2/BaxmRNA表达比值、降低Caspase-3mRNA表达水平。我们还发现，过表达miR-10b抵消了kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用、降低Bcl-2/BaxmRNA表达比值、升高Caspase-3mRNA表达水平。过表达PAI-1加强了kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用、升高Bcl-2/BaxmRNA表达比值、降低Caspase-3mRNA表达水平。
总之，我们研究结果表明，miR-10b可通过抑制PAI-1表达来促进牛卵巢颗粒细胞凋亡，kisspeptin可通过miR-10b/PAI-1途径抑制牛卵巢颗粒细胞凋亡。
第一部分，miR-10b通过PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。首先，将牛卵巢颗粒细胞转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和mimicsNC，48h后，利用quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测mR-10b表达量，利用流式细胞术、qRT-PCR和westernblot研究miR-10b对牛颗粒细胞凋亡、凋亡相关基因及PAI-1表达的影响；随后，构建PAI-1过表达质粒(pcDNA3.1-PAI-1)，将牛卵巢颗粒细胞转染pcDNA3.1-PAI-1和pcDNA3.1，48h后，利用qRT-PCR检测PAI-1的表达量，利用流式细胞术、qRT-PCR和westernblot研究PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响；在此基础上，将miR-10bmimics与pcDNA3.1-PAI-1或pcDNA3.1共转染牛卵巢颗粒细胞48h，利用流式细胞术和qRT-PCR研究miR-10b通过PAI-1对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。第二部分，kisspeptin通过miR-10b/PAI-1对牛卵巢颗粒细胞的作用。首先，将牛卵巢颗粒细胞转染miR-10bmimics和mimicsNC24h后，外源添加100nM的kp-10无血清处理24h，利用流式细胞术和qRT-PCR研究kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用与miR-10b的关系；随后，在牛卵巢颗粒细胞转染pcDNA3.1-PAI-1和pcDNA3.124h后，外源添加100nM的kp-10无血清处理24h，利用流式细胞术和qRT-PCR研究kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的作用与PAI-1的关系。
结果显示，miR-10b过表达组miR-10b表达量显著上升，提示转染成功。同时，过表达miR-10b可升高牛卵巢颗粒细胞凋亡率、降低Bcl-2/Bax表达比值、升高Caspase-3表达水平、降低PAI-1表达水平。PAI-1过表达组PAI-1表达量显著上升，提示转染成功。同时，过表达PAI-1可降低牛卵巢颗粒细胞凋亡率、升高Bcl-2/Bax表达比值、降低Caspase-3表达水平。此外，过表达PAI-1可抑制miR-10b诱导的凋亡、升高Bcl-2/BaxmRNA表达比值、降低Caspase-3mRNA表达水平。我们还发现，过表达miR-10b抵消了kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用、降低Bcl-2/BaxmRNA表达比值、升高Caspase-3mRNA表达水平。过表达PAI-1加强了kp-10对牛卵巢颗粒细胞凋亡的抑制作用、升高Bcl-2/BaxmRNA表达比值、降低Caspase-3mRNA表达水平。
总之，我们研究结果表明，miR-10b可通过抑制PAI-1表达来促进牛卵巢颗粒细胞凋亡，kisspeptin可通过miR-10b/PAI-1途径抑制牛卵巢颗粒细胞凋亡。