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断奶应激可导致仔猪机体发生氧化应激、炎症及内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)等现象。生物医学研究发现，氧化应激、ERS、炎症及细胞凋亡间可能存在复杂的分子网络调控机制。ERS与炎症反应间存在广泛的相互调控关系(cross-talk)。ERS标志蛋白肌醇需酶1(IRE1)可启动c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白参与机体炎症反应和细胞凋亡；双链RNA激活蛋白激酶样ER激酶(PERK)可激活信号转导转录激活因子-3(STAT3)参与机体炎症反应。因此，IRE1-JNK和PERK-Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/STAT3信号通路可能在该分子网络中起关键作用。然而，IRE1-JNK及PERK-JAK2/STAT3信号通路在早期断奶引发的仔猪机体炎症及细胞凋亡损伤中的作用未见报道。
β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，具有潜在抗炎及抗氧化能力。本课题组长期探究其功能发现β-胡萝卜素对早期断奶仔猪具促生长、提高免疫力、减轻小肠炎症及ERS等作用。然而，β-胡萝卜素能否通过调节IRE1-JNK及PERK-JAK2/STAT3信号通路缓解断奶仔猪炎症及细胞凋亡进而缓解断奶应激尚不明确。本研究通过营养干预手段探究β-胡萝卜素对早期断奶造成的仔猪机体炎症及细胞凋亡的作用机理。
本研究首先选取72头雄性初生仔猪并随机分为4组(对照组(CON)；断奶组(WG)；低剂量β-胡萝卜素(40 mg/kg)组(LCBC)；高剂量β-胡萝卜素(80 mg/kg)组(HCBC))。断奶后1天、5天和7天采集血清、空肠及肝脏组织。通过生物化学法、ELISA、H＆E染色、TUNEL染色、QPCR、免疫组化及Westernblot等方法检测β-胡萝卜素对早期断奶仔猪机体氧化应激、ERS、炎症及细胞凋亡的影响。结果发现：β-胡萝卜素能提高仔猪平均日增重，显著降低腹泻率并降低空肠和肝脏组织形态损伤，降低氧化损伤并提高抗氧化能力；能够降低血清中促炎因子水平；降低空肠及肝脏组织中p-JAK2、p-STAT3和p-NF-κB蛋白表达量；降低断奶仔猪空肠和肝脏组织中IRE1和PERKmRNA表达量，降低GRP78、p-PERK及p-IRE1蛋白表达水平；可显著降低仔猪空肠和肝脏组织凋亡细胞数量；能降低Caspase-3、9、12mRNA表达水平，降低p-JNK、Bax和Caspase-3蛋白表达量，提高Bcl-2蛋白表达量。提示早期断奶可引发仔猪机体氧化应激、炎症、ERS及细胞凋亡现象，β-胡萝卜素能够缓解这些现象。
然后，取断奶后5天仔猪为模型，采集仔猪粪便，通过16SrRNA高通量测序技术检测β-胡萝卜素对仔猪粪便微生物的影响，从肠道微生物的角度探究β-胡萝卜素的抗炎作用机理。结果发现：β-胡萝卜素能有效缓解结肠组织损伤；显著降低仔猪粪便微生物中Bacteroidetes菌门以及Blautia和Prevotella菌属的相对丰度，显著升高Firmicutes菌门以及p-75-a5和Parabacteroides菌属相对丰度。结合血清中促炎细胞因子水平进行Spearman’s相关性分析结果显示，Prevotella和Blautia菌属与仔猪血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平呈正相关,Parabacteroides和Synergistes呈负相关,p-75-a5与血清中IL-6呈负相关。提示早期断奶能够改变仔猪肠道菌群结构和组成，β-胡萝卜素可能通过调节肠道菌群缓解仔猪肠道炎症反应。
最后，依据“肠肝轴”学说，分别用仔猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)和新生仔猪肝原代细胞建立4种细胞模型验证β-胡萝卜素干预仔猪断奶应激的作用机理。(1)在IPEC-J2细胞系中：采用脂多糖(LPS)建立炎症模型，发现IRE1蛋白同时被激活，β-胡萝卜素预保护能够降低p-IRE1、p-JNK、p-NF-κBP65、Caspase-3和Bax蛋白表达量，增加Bcl-2蛋白表达量，且呈剂量依赖性，并能够缓解LPS诱导的细胞凋亡。抑制IRE1和JNK蛋白后β-胡萝卜素对炎症反应和细胞凋亡的缓解作用显著下降；另外，采用毒胡萝卜素(TG)刺激IPEC-J2细胞建立ERS模型，发现JAK2/STAT3通路同时被激活，β-胡萝卜素预保护能够以剂量依赖的方式抑制TG激活的GRP78、p-PERK、p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κBP65和CHOP蛋白表达量。另外，β-胡萝卜素降低了Bax/Bcl-2比例及Caspase-3蛋白表达量。抑制PERK和JAK2蛋白后β-胡萝卜素对炎症和细胞凋亡的缓解作用显著减弱；(2)在新生仔猪肝原代细胞模型中：分别通过LPS和TG建立炎症和ERS模型并对上述试验进行验证，呈现出与IPEC-J2细胞相似结果。
综上所述，本研究发现早期断奶造成了仔猪机体氧化应激、炎症、ERS、细胞凋亡及肠道菌群结构和组成平衡改变一系列现象，β-胡萝卜素干预可缓解这些现象。进一步探究发现，β-胡萝卜素通过干预IRE1-JNK及PERK-JAK2/STAT3信号通路，影响ERS和炎症反应间cross-talk，从而缓解炎症反应及细胞凋亡。本研究为β-胡萝卜素干预早期断奶仔猪机体炎症及细胞凋亡损伤的作用机理提供了新的理论依据，并为进一步探究β-胡萝卜素功能应用奠定理论基础。
β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，具有潜在抗炎及抗氧化能力。本课题组长期探究其功能发现β-胡萝卜素对早期断奶仔猪具促生长、提高免疫力、减轻小肠炎症及ERS等作用。然而，β-胡萝卜素能否通过调节IRE1-JNK及PERK-JAK2/STAT3信号通路缓解断奶仔猪炎症及细胞凋亡进而缓解断奶应激尚不明确。本研究通过营养干预手段探究β-胡萝卜素对早期断奶造成的仔猪机体炎症及细胞凋亡的作用机理。
本研究首先选取72头雄性初生仔猪并随机分为4组(对照组(CON)；断奶组(WG)；低剂量β-胡萝卜素(40 mg/kg)组(LCBC)；高剂量β-胡萝卜素(80 mg/kg)组(HCBC))。断奶后1天、5天和7天采集血清、空肠及肝脏组织。通过生物化学法、ELISA、H＆E染色、TUNEL染色、QPCR、免疫组化及Westernblot等方法检测β-胡萝卜素对早期断奶仔猪机体氧化应激、ERS、炎症及细胞凋亡的影响。结果发现：β-胡萝卜素能提高仔猪平均日增重，显著降低腹泻率并降低空肠和肝脏组织形态损伤，降低氧化损伤并提高抗氧化能力；能够降低血清中促炎因子水平；降低空肠及肝脏组织中p-JAK2、p-STAT3和p-NF-κB蛋白表达量；降低断奶仔猪空肠和肝脏组织中IRE1和PERKmRNA表达量，降低GRP78、p-PERK及p-IRE1蛋白表达水平；可显著降低仔猪空肠和肝脏组织凋亡细胞数量；能降低Caspase-3、9、12mRNA表达水平，降低p-JNK、Bax和Caspase-3蛋白表达量，提高Bcl-2蛋白表达量。提示早期断奶可引发仔猪机体氧化应激、炎症、ERS及细胞凋亡现象，β-胡萝卜素能够缓解这些现象。
然后，取断奶后5天仔猪为模型，采集仔猪粪便，通过16SrRNA高通量测序技术检测β-胡萝卜素对仔猪粪便微生物的影响，从肠道微生物的角度探究β-胡萝卜素的抗炎作用机理。结果发现：β-胡萝卜素能有效缓解结肠组织损伤；显著降低仔猪粪便微生物中Bacteroidetes菌门以及Blautia和Prevotella菌属的相对丰度，显著升高Firmicutes菌门以及p-75-a5和Parabacteroides菌属相对丰度。结合血清中促炎细胞因子水平进行Spearman’s相关性分析结果显示，Prevotella和Blautia菌属与仔猪血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平呈正相关,Parabacteroides和Synergistes呈负相关,p-75-a5与血清中IL-6呈负相关。提示早期断奶能够改变仔猪肠道菌群结构和组成，β-胡萝卜素可能通过调节肠道菌群缓解仔猪肠道炎症反应。
最后，依据“肠肝轴”学说，分别用仔猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)和新生仔猪肝原代细胞建立4种细胞模型验证β-胡萝卜素干预仔猪断奶应激的作用机理。(1)在IPEC-J2细胞系中：采用脂多糖(LPS)建立炎症模型，发现IRE1蛋白同时被激活，β-胡萝卜素预保护能够降低p-IRE1、p-JNK、p-NF-κBP65、Caspase-3和Bax蛋白表达量，增加Bcl-2蛋白表达量，且呈剂量依赖性，并能够缓解LPS诱导的细胞凋亡。抑制IRE1和JNK蛋白后β-胡萝卜素对炎症反应和细胞凋亡的缓解作用显著下降；另外，采用毒胡萝卜素(TG)刺激IPEC-J2细胞建立ERS模型，发现JAK2/STAT3通路同时被激活，β-胡萝卜素预保护能够以剂量依赖的方式抑制TG激活的GRP78、p-PERK、p-JAK2、p-STAT3、p-NF-κBP65和CHOP蛋白表达量。另外，β-胡萝卜素降低了Bax/Bcl-2比例及Caspase-3蛋白表达量。抑制PERK和JAK2蛋白后β-胡萝卜素对炎症和细胞凋亡的缓解作用显著减弱；(2)在新生仔猪肝原代细胞模型中：分别通过LPS和TG建立炎症和ERS模型并对上述试验进行验证，呈现出与IPEC-J2细胞相似结果。
综上所述，本研究发现早期断奶造成了仔猪机体氧化应激、炎症、ERS、细胞凋亡及肠道菌群结构和组成平衡改变一系列现象，β-胡萝卜素干预可缓解这些现象。进一步探究发现，β-胡萝卜素通过干预IRE1-JNK及PERK-JAK2/STAT3信号通路，影响ERS和炎症反应间cross-talk，从而缓解炎症反应及细胞凋亡。本研究为β-胡萝卜素干预早期断奶仔猪机体炎症及细胞凋亡损伤的作用机理提供了新的理论依据，并为进一步探究β-胡萝卜素功能应用奠定理论基础。