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大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)是大豆中重要的抗营养因子,它通过与动物肠道上皮细胞特异性结合，影响肠道细胞多种生物学功能。研究发现仔猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)膜上能与SBA特异性结合蛋白中一类为细胞骨架蛋白，细胞骨架蛋白是细胞重要的组成成分，对维持细胞正常形态和功能有重要作用，同时对细胞的凋亡、迁移和增殖等生物学功能具有重要的影响。目前关于SBA引起细胞生物学功能改变的机制尚不明确，根据SBA与细胞骨架蛋白的结构与功能特点，我们推断SBA可能通过与细胞骨架蛋白结合，进而影响肠道上皮细胞的增殖与凋亡，产生抗营养作用。因此，本试验选取IPEC-J2细胞膜上与SBA特异性结合且具有代表性细胞骨架蛋白角蛋白8(KRT8)、角蛋白18(KRT18)和肌动蛋白(ACTA)进行研究，揭示SBA对细胞周期及凋亡等生物学功能的影响，以及三种细胞骨架蛋白在IPEC-J2细胞周期和凋亡及SBA诱导的IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中的作用，为深入认识SBA的抗营养作用的分子机制奠定基础。
实验一：SBA对IPEC-J2细胞周期、凋亡及三种细胞骨架蛋白基因及蛋白表达量的影响。
采用流式细胞仪测定0mg/mL和2.0mg/mLSBA对IPEC-J2细胞周期及凋亡的影响。采用荧光定量PCR技术测定SBA对细胞骨架蛋白KRT8，KRT18和ACTA基因表达量的影响。采用Western-blot和免疫荧光技术测定SBA对细胞骨架蛋白KRT8，KRT18和ACTA蛋白表达量的影响。采用二因子方差数理统计模型对数据进行分析。
试验结果显示SBA可通过阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期而抑制细胞增殖，引起细胞凋亡(P＜0.05)。此外，SBA会显著降低KRT8，KRT18和ACTA三种细胞骨架蛋白mRNA的转录以及蛋白的翻译(P＜0.05)。
实验二：三种细胞骨架蛋白在维持IPEC-J2细胞生物学功能中的比较及三种骨架蛋白在SBA诱导的IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中的作用。
选取生长状态良好的IPEC-J2细胞，采用基因沉默技术(si-RNA转染试验)对细胞进行处理。每种细胞骨架蛋白由试剂公司设计三种抑制基因处理组与阴性对照组基因(NC对照组)，再加上空白对照组，共五个处理组，通过荧光定量PCR技术筛选三种细胞骨架蛋白基因沉默效率最佳的si-RNA序列。为了探明哪种细胞骨架蛋白或者哪种细胞骨架蛋白组合在IPEC-J2细胞周期和凋亡以及SBA引起IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中发挥的作用最为显著。本试验设计16个处理组，包括不沉默任何一种基因(对照组)、只沉默一种基因、同时沉默两种基因、和同时沉默三种基因(即C30+C31+C32+C33),以及在上述八个处理的基础上每个处理再分别添加2.0mg/mLSBA。通过流式细胞仪测定不同处理组中IPEC-J2细胞周期和凋亡的变化情况。数理统计模型为单因子方差模型。
通过对试验结果分析最终选取KRT8-siRNA3，ACTA1-siRNA2，KRT18-siRNA3为实验最佳si-RNA序列。周期测定试验结果显示，任何一种细胞骨架或者细胞骨架组合基因沉默处理后均会引起IPEC-J2细胞周期G0/Gl期的阻滞(P＜0.05)。只沉默一种基因后，不同细胞骨架基因沉默处理对IPEC-J2细胞周期G0/Gl期细胞阻滞程度存在差别，强度的先后顺序分别为ACTA-siRNA2＞KRT8-siRNA3＞KRT18-siRNA3(P＜0.05)，同时沉默两种基因后IPEC-J2细胞周期G0/Gl期的阻滞程度为KRT8-siRNA3+KRT18-siRNA3＞KRT8-siRNA3+ACTA-siRNA2＞KRT18-siRNA3+ACTA-siRNA2(P＜0.05)。同时沉默三种基因对IPEC-J2细胞周期G0/G1期的阻滞程度高于只沉默一种基因和同时沉默两种基因，说明三种细胞骨架蛋白可能在维持IPEC-J2细胞正常周期中存在一定的累加作用。在不同细胞骨架蛋白基因沉默处理组中添加2.0mg/mLSBA后对IPEC-J2细胞周期G0/G1期的阻滞作用高于所有基因沉默处理组(P＜0.05)，且不同细胞骨架沉默+SBA处理组之间对细胞周期的影响程度差异不显著(P＞0.05)。虽然不同细胞骨架蛋白之间或者细胞骨架蛋白组合之间在维持IPEC-J2周期中发挥的作用强度存在差别，但是当加入SBA后，单一细胞骨架蛋白沉默+SBA处理组以及同时沉默两种细胞骨架蛋白+SBA处理组对细胞周期的阻滞作用高于SBA处理组，且阻滞作用表现为一致性，并且在同时沉默三种骨架蛋白+SBA处理组中对细胞周期的阻滞作用达到最高。产生这种阻滞程度增加的原因可能是由于骨架蛋白表达量的降低而引起的。当SBA与三种细胞骨架蛋白结合后，会降低细胞骨架蛋白的表达量，进而影响细胞周期的阻滞，并且三种骨架蛋白在SBA引起细胞周期改变过程中发挥了一定的累加作用。
凋亡测定试验结果显示，三种细胞骨架蛋白基因沉默处理引起IPEC-J2细胞凋亡的程度与细胞周期结果相一致，且不同细胞骨架蛋白组合基因沉默后对细胞凋亡率的促进作用具有一定的累加性。除此之外，添加2.0mg/mLSBA后显著会增加IPEC-J2细胞凋亡比例(P＜0.05)，且这种作用强度高于同时沉默两种基因和只沉默一种基因处理组。加入SBA后，SBA与细胞骨架蛋白的作用与周期结果原理相同。
综上所述，SBA可阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期，且SBA会导致细胞凋亡比例显著增加。此外，SBA会显著降低细胞骨架蛋白KRT8，KRT18和ACTA的基因以及蛋白表达量。抑制细胞骨架蛋白基因表达会引起细胞周期阻滞和细胞凋亡增加，三种细胞骨架蛋白对周期和凋亡的影响程度为ACTA＞KRT8＞KRT18。在SBA诱导的IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中，SBA与细胞骨架蛋白结合可能封闭细胞骨架蛋白的活性位点，抑制细胞骨架蛋白的表达，细胞骨架蛋白的抑制引起细胞骨架塌陷，同时可能会增加细胞表面死亡受体，导致细胞周期阻滞和凋亡增加。
实验一：SBA对IPEC-J2细胞周期、凋亡及三种细胞骨架蛋白基因及蛋白表达量的影响。
采用流式细胞仪测定0mg/mL和2.0mg/mLSBA对IPEC-J2细胞周期及凋亡的影响。采用荧光定量PCR技术测定SBA对细胞骨架蛋白KRT8，KRT18和ACTA基因表达量的影响。采用Western-blot和免疫荧光技术测定SBA对细胞骨架蛋白KRT8，KRT18和ACTA蛋白表达量的影响。采用二因子方差数理统计模型对数据进行分析。
试验结果显示SBA可通过阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期而抑制细胞增殖，引起细胞凋亡(P＜0.05)。此外，SBA会显著降低KRT8，KRT18和ACTA三种细胞骨架蛋白mRNA的转录以及蛋白的翻译(P＜0.05)。
实验二：三种细胞骨架蛋白在维持IPEC-J2细胞生物学功能中的比较及三种骨架蛋白在SBA诱导的IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中的作用。
选取生长状态良好的IPEC-J2细胞，采用基因沉默技术(si-RNA转染试验)对细胞进行处理。每种细胞骨架蛋白由试剂公司设计三种抑制基因处理组与阴性对照组基因(NC对照组)，再加上空白对照组，共五个处理组，通过荧光定量PCR技术筛选三种细胞骨架蛋白基因沉默效率最佳的si-RNA序列。为了探明哪种细胞骨架蛋白或者哪种细胞骨架蛋白组合在IPEC-J2细胞周期和凋亡以及SBA引起IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中发挥的作用最为显著。本试验设计16个处理组，包括不沉默任何一种基因(对照组)、只沉默一种基因、同时沉默两种基因、和同时沉默三种基因(即C30+C31+C32+C33),以及在上述八个处理的基础上每个处理再分别添加2.0mg/mLSBA。通过流式细胞仪测定不同处理组中IPEC-J2细胞周期和凋亡的变化情况。数理统计模型为单因子方差模型。
通过对试验结果分析最终选取KRT8-siRNA3，ACTA1-siRNA2，KRT18-siRNA3为实验最佳si-RNA序列。周期测定试验结果显示，任何一种细胞骨架或者细胞骨架组合基因沉默处理后均会引起IPEC-J2细胞周期G0/Gl期的阻滞(P＜0.05)。只沉默一种基因后，不同细胞骨架基因沉默处理对IPEC-J2细胞周期G0/Gl期细胞阻滞程度存在差别，强度的先后顺序分别为ACTA-siRNA2＞KRT8-siRNA3＞KRT18-siRNA3(P＜0.05)，同时沉默两种基因后IPEC-J2细胞周期G0/Gl期的阻滞程度为KRT8-siRNA3+KRT18-siRNA3＞KRT8-siRNA3+ACTA-siRNA2＞KRT18-siRNA3+ACTA-siRNA2(P＜0.05)。同时沉默三种基因对IPEC-J2细胞周期G0/G1期的阻滞程度高于只沉默一种基因和同时沉默两种基因，说明三种细胞骨架蛋白可能在维持IPEC-J2细胞正常周期中存在一定的累加作用。在不同细胞骨架蛋白基因沉默处理组中添加2.0mg/mLSBA后对IPEC-J2细胞周期G0/G1期的阻滞作用高于所有基因沉默处理组(P＜0.05)，且不同细胞骨架沉默+SBA处理组之间对细胞周期的影响程度差异不显著(P＞0.05)。虽然不同细胞骨架蛋白之间或者细胞骨架蛋白组合之间在维持IPEC-J2周期中发挥的作用强度存在差别，但是当加入SBA后，单一细胞骨架蛋白沉默+SBA处理组以及同时沉默两种细胞骨架蛋白+SBA处理组对细胞周期的阻滞作用高于SBA处理组，且阻滞作用表现为一致性，并且在同时沉默三种骨架蛋白+SBA处理组中对细胞周期的阻滞作用达到最高。产生这种阻滞程度增加的原因可能是由于骨架蛋白表达量的降低而引起的。当SBA与三种细胞骨架蛋白结合后，会降低细胞骨架蛋白的表达量，进而影响细胞周期的阻滞，并且三种骨架蛋白在SBA引起细胞周期改变过程中发挥了一定的累加作用。
凋亡测定试验结果显示，三种细胞骨架蛋白基因沉默处理引起IPEC-J2细胞凋亡的程度与细胞周期结果相一致，且不同细胞骨架蛋白组合基因沉默后对细胞凋亡率的促进作用具有一定的累加性。除此之外，添加2.0mg/mLSBA后显著会增加IPEC-J2细胞凋亡比例(P＜0.05)，且这种作用强度高于同时沉默两种基因和只沉默一种基因处理组。加入SBA后，SBA与细胞骨架蛋白的作用与周期结果原理相同。
综上所述，SBA可阻滞IPEC-J2细胞周期于G0/G1期，且SBA会导致细胞凋亡比例显著增加。此外，SBA会显著降低细胞骨架蛋白KRT8，KRT18和ACTA的基因以及蛋白表达量。抑制细胞骨架蛋白基因表达会引起细胞周期阻滞和细胞凋亡增加，三种细胞骨架蛋白对周期和凋亡的影响程度为ACTA＞KRT8＞KRT18。在SBA诱导的IPEC-J2细胞周期和凋亡改变中，SBA与细胞骨架蛋白结合可能封闭细胞骨架蛋白的活性位点，抑制细胞骨架蛋白的表达，细胞骨架蛋白的抑制引起细胞骨架塌陷，同时可能会增加细胞表面死亡受体，导致细胞周期阻滞和凋亡增加。