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摘要：目的 观察骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡和凋亡调控基因bcl-2、bax的影响，并探讨其作用机理。方法 选用健康日本大耳白兔40只，随机分为骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组、空白对照组、正常组。Videman固定法进行改良制备兔膝关节骨性关节炎模型，骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组外敷相应药物，空白对照组、正常组不做任何处理，给药5周后处死动物，TUNEL法检测软骨细胞凋亡，免疫组化法检测关节软骨中bcl-2、bax的水平。结果 骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组细胞凋亡率明显低于空白对照组（P<0.05）；bcl-2在骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组中的表达高于空白对照组（P<0.05），bax的表达低于空白对照组（P<0.05），骨刺消巴布剂组与奇正消痛贴组比较差异无统计学意义。结论 骨刺消巴布剂可能是通过上调bcl-2的表达、下调bax的表达来抑制兔膝关节骨性关节炎软骨细胞的过度凋亡，这可能是该药治疗骨性关节炎的机制之一。
关键词：膝关节骨性关节炎；骨刺消巴布剂；细胞凋亡；bcl-2蛋白；bax蛋白；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0039-03
膝关节骨性关节炎是以膝关节软骨退变及破坏为主要病变特征，多发于老年人的一种慢性退行性关节疾病，其病因病机目前尚未明确，但最终都是由于软骨细胞的过度凋亡，进而导致软骨的破坏。如何减少软骨细胞的过度凋亡，保持软骨细胞增殖与凋亡的平衡，是预防和治疗膝关节骨性关节炎的关键所在[1]。我们通过观察骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡和凋亡调控基因bcl-2、bax的影响，探讨骨刺消巴布剂治疗和预防膝关节骨性关节炎的作用机理。
基金项目：甘肃省中医药科学技术研究课题（GZK-2011-66）
1 实验材料
1.1 药物
骨刺消巴布剂由本院药剂科制备，批号：甘药制字Z11012102， 规格：70 mm×100 mm；奇正消痛贴，奇正藏药集团生产，批号110928，规格：90 mm×120 mm。
1.2 动物
清洁级日本大耳白兔40只，由兰州大学医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK（甘）2009-0004，分笼饲养，自由饮水，饲料为该中心提供的标准全价饲料。动物房温度（25±3）℃，相对湿度（60±5）%，光暗周期24 h，为正常昼夜节律。
1.3 试剂与仪器
bc1-2、bax鼠抗人单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DBA显色试剂盒试剂盒均购于武汉博士德公司。德国Leica EG1160型包埋机，德国Leica RM2126型轮转切片机，显微镜日产Olympus BX50型。
2 实验方法
2.1 分组与造模
40只大耳白兔，采用随机数字表法分为骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组、空白对照组、正常组，每组10只。除正常组外，其余3组均采用经典的Videman固定法进行改良制备兔膝关节骨性关节炎模型[2]：于日本大耳白兔左后肢固定区域包裹棉垫，左下肢外侧安置小铝板（接触皮肤侧垫脱脂棉，长度同管型石膏），再以管型石膏固定（长度从股骨上端至踝关节上1 cm），待石膏定型后，在兔左后肢膝关节前方做2 cm×4 cm开窗处理，待石膏干硬后放回兔笼，单笼喂养，同时用废硬胶片做成“伊丽莎白圈”，反套在兔颈部固定，避免兔撕咬石膏。
造模8周后，处死动物，取左膝关节标本，肉眼观察可见关节囊明显增厚，关节液黄色浑浊，量较多，关节软骨呈灰黄色，软骨表面不光滑，局部出现溃疡，关节边缘有骨赘增生，光镜下观察浅表区可见粗糙或有炎性肿胀，产生裂隙，深达辐射区，深层细胞数目异常，表现为细胞数目减少或簇聚，即可判定兔膝关节骨性关节炎模型成功。
2.2 给药与取材
待造模成功后，立即给予药物干预。骨刺消巴布剂组外敷骨刺消巴布剂，3 d更换1次；奇正消痛贴组外敷奇正消痛贴， 3 d更换1次；空白对照组、正常组不予任何处理。所有动物于给药5周末取材，空气栓塞法处死动物，解剖左膝关节，用咬骨钳、手术刀取股骨髁部，保留软骨组织，放入4%多聚甲醛固定。将标本修剪成3 mm×3 mm×3 mm的组织块，EDTA脱钙8周后石蜡包埋，连续切片，厚度为3 ?m。
2.3 检测方法
2.3.1 细胞凋亡指数测定 将石蜡切片行TUNEL染色。石蜡切片常规脱蜡水化，蛋白酶K（20 mg/L）室温水解10 min，2%H2O2室温反应5 min，PBS漂洗，TdT酶缓冲液室温孵育5 min，TdT酶反应液湿盒内37 ℃孵育60 min（阴性染色加不含TdT酶的反应液），加入2XSSC终止反应，PBS漂洗，加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，PBS漂洗，0.05%DAB显色6 min，常规脱水、封固，光镜下观察。显微镜下每张切片选10个高倍视野（×40），细胞核中有棕黄色颗粒者，染色质呈明亮的凝聚块，单个凋亡的软骨细胞与周围细胞分离，细胞皱缩呈卵圆形或圆形的为TUNEL染色阳性的凋亡软骨细胞[3]。通过Image-Pro Plus图像处理软件计数软骨细胞总数和TUNEL阳性细胞数，根据公式计算凋亡指数。凋亡指数=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。
2.3.2 细胞凋亡调控基因bc1-2和bax蛋白表达测定 按照戴氏等[3]的方法，bcl-2、bax的表达量通过计算阳性细胞率来表示。在高倍镜下观察（×40），每张切片随机选取10个视野，光镜下，细胞浆中有明显的棕黄色细颗粒者为阳性细胞，其他细胞均视为阴性细胞。通过Image-Pro Plus图像处理软件计算每个视野的阳性细胞数及细胞总数，计算bcl-2、bax的表达率。bcl-2、bax的表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%。 3 统计学方法
采用SPSS16.0软件进行分析，数据以—x±s表示，多组均数比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
5 讨论
膝关节骨性关节炎属于中医学“痹证”范畴。中医认为，骨性关节炎与“虚”、“邪”、“瘀”密切相关，风、寒、湿三邪是主要的致病因素，多以肝肾亏虚为其本，风、寒、湿邪侵于肌肉、筋骨、关节之间，导致气血凝滞，脉络痹阻。骨刺消巴布剂是本院院内制剂骨刺膏临床应用10余年的改良剂型，由制川乌、制草乌、马钱子、当归、川芎、红花等11味中药组成，具有温阳活血、舒经活络、祛痹止痛等功效。
目前膝关节骨性关节炎动物模型的建立有多种方法，主要分为关节制动法、手术方法和关节腔注射等方法[4]，在本实验中，我们采用改良的经典Videman固定法来制造兔膝关节骨性关节炎模型，相对于手术方法和关节腔注射法，具有无手术创伤和无关节腔内影响的优点，更接近于自然过程，这对我们研究软骨细胞的凋亡和凋亡调控基因bcl-2及其抑制基因bax可减少干扰因素，使实验结果更为可靠。
凋亡是细胞的一种死亡形式，于1972年首先由Kerr[5]、Wyllie和Currie确认，细胞凋亡受多种基因调节，这些基因包括抑制细胞凋亡的bcl-2、bcl-x1、BHRF1和ced-9，促进细胞凋亡的bax、bcl-Xs、P53、Bad和Bak及参与细胞存活调节的Mcl-1的A1和LMW5-HL，其中起主要作用的是bcl-2/bax。bcl-2与bax同属bcl-2蛋白家族，其中bcl-2是bcl-2基因家族中抑凋亡蛋白，bax是该基因家族中促凋亡蛋白，细胞凋亡的发生还与bc1-2/bax比值有关，比值高则细胞存活率高，比值低则细胞存活率低。测定bcl-2/bax比值可判断是否发生凋亡[6]。在本实验中我们发现：骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组细胞凋亡率明显低于空白对照组（P<0.05），bcl-2在骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组中的表达高于空白对照组（P<0.05），bax的表达低于空白对照组（P<0.05），故骨刺消巴布剂可能是通过上调bcl-2的表达、下调bax的表达来抑制兔软骨细胞的过度凋亡，从而达到预防和治疗膝关节骨性关节炎的目的，这可能是该药治疗骨性关节炎机制之一。
参考文献：
[1] 黄涛，李钢林，李楠，等.巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞凋亡的影响[J].北京体育大学学报，2010，33（8）：56-60.
[2] 熊勇，张照庆，夏数数，等.改良伸直位固定法建立兔膝关节骨性关节炎模型的研究[J].湖北中医学院学报，2010，12（5）：19-21.
[3] 戴七一，阮萍，崔伟，等.揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Fas表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（46）：8556-8560.
[4] 张丽娜，凌沛学，娄红祥，等.生化药物在治疗骨关节炎中的应用及兔膝骨关节炎造模方法[J].中国生化药物杂志，2007，28（4）：283-285.
[5] Kerr JFR， Searle J. Deletion of cells by apoptosis during castration[J]. Vir-chow Arch B，1973，13：87.
[6] 朱永磊.针刺对细胞凋亡的影响[J].中医药临床杂志，2007，19（2）：102-104.
（收稿日期：2012-05-02，编辑：华强）
关键词：膝关节骨性关节炎；骨刺消巴布剂；细胞凋亡；bcl-2蛋白；bax蛋白；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0039-03
膝关节骨性关节炎是以膝关节软骨退变及破坏为主要病变特征，多发于老年人的一种慢性退行性关节疾病，其病因病机目前尚未明确，但最终都是由于软骨细胞的过度凋亡，进而导致软骨的破坏。如何减少软骨细胞的过度凋亡，保持软骨细胞增殖与凋亡的平衡，是预防和治疗膝关节骨性关节炎的关键所在[1]。我们通过观察骨刺消巴布剂对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞凋亡和凋亡调控基因bcl-2、bax的影响，探讨骨刺消巴布剂治疗和预防膝关节骨性关节炎的作用机理。
基金项目：甘肃省中医药科学技术研究课题（GZK-2011-66）
1 实验材料
1.1 药物
骨刺消巴布剂由本院药剂科制备，批号：甘药制字Z11012102， 规格：70 mm×100 mm；奇正消痛贴，奇正藏药集团生产，批号110928，规格：90 mm×120 mm。
1.2 动物
清洁级日本大耳白兔40只，由兰州大学医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK（甘）2009-0004，分笼饲养，自由饮水，饲料为该中心提供的标准全价饲料。动物房温度（25±3）℃，相对湿度（60±5）%，光暗周期24 h，为正常昼夜节律。
1.3 试剂与仪器
bc1-2、bax鼠抗人单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DBA显色试剂盒试剂盒均购于武汉博士德公司。德国Leica EG1160型包埋机，德国Leica RM2126型轮转切片机，显微镜日产Olympus BX50型。
2 实验方法
2.1 分组与造模
40只大耳白兔，采用随机数字表法分为骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组、空白对照组、正常组，每组10只。除正常组外，其余3组均采用经典的Videman固定法进行改良制备兔膝关节骨性关节炎模型[2]：于日本大耳白兔左后肢固定区域包裹棉垫，左下肢外侧安置小铝板（接触皮肤侧垫脱脂棉，长度同管型石膏），再以管型石膏固定（长度从股骨上端至踝关节上1 cm），待石膏定型后，在兔左后肢膝关节前方做2 cm×4 cm开窗处理，待石膏干硬后放回兔笼，单笼喂养，同时用废硬胶片做成“伊丽莎白圈”，反套在兔颈部固定，避免兔撕咬石膏。
造模8周后，处死动物，取左膝关节标本，肉眼观察可见关节囊明显增厚，关节液黄色浑浊，量较多，关节软骨呈灰黄色，软骨表面不光滑，局部出现溃疡，关节边缘有骨赘增生，光镜下观察浅表区可见粗糙或有炎性肿胀，产生裂隙，深达辐射区，深层细胞数目异常，表现为细胞数目减少或簇聚，即可判定兔膝关节骨性关节炎模型成功。
2.2 给药与取材
待造模成功后，立即给予药物干预。骨刺消巴布剂组外敷骨刺消巴布剂，3 d更换1次；奇正消痛贴组外敷奇正消痛贴， 3 d更换1次；空白对照组、正常组不予任何处理。所有动物于给药5周末取材，空气栓塞法处死动物，解剖左膝关节，用咬骨钳、手术刀取股骨髁部，保留软骨组织，放入4%多聚甲醛固定。将标本修剪成3 mm×3 mm×3 mm的组织块，EDTA脱钙8周后石蜡包埋，连续切片，厚度为3 ?m。
2.3 检测方法
2.3.1 细胞凋亡指数测定 将石蜡切片行TUNEL染色。石蜡切片常规脱蜡水化，蛋白酶K（20 mg/L）室温水解10 min，2%H2O2室温反应5 min，PBS漂洗，TdT酶缓冲液室温孵育5 min，TdT酶反应液湿盒内37 ℃孵育60 min（阴性染色加不含TdT酶的反应液），加入2XSSC终止反应，PBS漂洗，加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，PBS漂洗，0.05%DAB显色6 min，常规脱水、封固，光镜下观察。显微镜下每张切片选10个高倍视野（×40），细胞核中有棕黄色颗粒者，染色质呈明亮的凝聚块，单个凋亡的软骨细胞与周围细胞分离，细胞皱缩呈卵圆形或圆形的为TUNEL染色阳性的凋亡软骨细胞[3]。通过Image-Pro Plus图像处理软件计数软骨细胞总数和TUNEL阳性细胞数，根据公式计算凋亡指数。凋亡指数=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。
2.3.2 细胞凋亡调控基因bc1-2和bax蛋白表达测定 按照戴氏等[3]的方法，bcl-2、bax的表达量通过计算阳性细胞率来表示。在高倍镜下观察（×40），每张切片随机选取10个视野，光镜下，细胞浆中有明显的棕黄色细颗粒者为阳性细胞，其他细胞均视为阴性细胞。通过Image-Pro Plus图像处理软件计算每个视野的阳性细胞数及细胞总数，计算bcl-2、bax的表达率。bcl-2、bax的表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%。 3 统计学方法
采用SPSS16.0软件进行分析，数据以—x±s表示，多组均数比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
5 讨论
膝关节骨性关节炎属于中医学“痹证”范畴。中医认为，骨性关节炎与“虚”、“邪”、“瘀”密切相关，风、寒、湿三邪是主要的致病因素，多以肝肾亏虚为其本，风、寒、湿邪侵于肌肉、筋骨、关节之间，导致气血凝滞，脉络痹阻。骨刺消巴布剂是本院院内制剂骨刺膏临床应用10余年的改良剂型，由制川乌、制草乌、马钱子、当归、川芎、红花等11味中药组成，具有温阳活血、舒经活络、祛痹止痛等功效。
目前膝关节骨性关节炎动物模型的建立有多种方法，主要分为关节制动法、手术方法和关节腔注射等方法[4]，在本实验中，我们采用改良的经典Videman固定法来制造兔膝关节骨性关节炎模型，相对于手术方法和关节腔注射法，具有无手术创伤和无关节腔内影响的优点，更接近于自然过程，这对我们研究软骨细胞的凋亡和凋亡调控基因bcl-2及其抑制基因bax可减少干扰因素，使实验结果更为可靠。
凋亡是细胞的一种死亡形式，于1972年首先由Kerr[5]、Wyllie和Currie确认，细胞凋亡受多种基因调节，这些基因包括抑制细胞凋亡的bcl-2、bcl-x1、BHRF1和ced-9，促进细胞凋亡的bax、bcl-Xs、P53、Bad和Bak及参与细胞存活调节的Mcl-1的A1和LMW5-HL，其中起主要作用的是bcl-2/bax。bcl-2与bax同属bcl-2蛋白家族，其中bcl-2是bcl-2基因家族中抑凋亡蛋白，bax是该基因家族中促凋亡蛋白，细胞凋亡的发生还与bc1-2/bax比值有关，比值高则细胞存活率高，比值低则细胞存活率低。测定bcl-2/bax比值可判断是否发生凋亡[6]。在本实验中我们发现：骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组细胞凋亡率明显低于空白对照组（P<0.05），bcl-2在骨刺消巴布剂组、奇正消痛贴组中的表达高于空白对照组（P<0.05），bax的表达低于空白对照组（P<0.05），故骨刺消巴布剂可能是通过上调bcl-2的表达、下调bax的表达来抑制兔软骨细胞的过度凋亡，从而达到预防和治疗膝关节骨性关节炎的目的，这可能是该药治疗骨性关节炎机制之一。
参考文献：
[1] 黄涛，李钢林，李楠，等.巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞凋亡的影响[J].北京体育大学学报，2010，33（8）：56-60.
[2] 熊勇，张照庆，夏数数，等.改良伸直位固定法建立兔膝关节骨性关节炎模型的研究[J].湖北中医学院学报，2010，12（5）：19-21.
[3] 戴七一，阮萍，崔伟，等.揉髌手法对兔膝关节软骨细胞凋亡及Bcl-2、Bax和Fas表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（46）：8556-8560.
[4] 张丽娜，凌沛学，娄红祥，等.生化药物在治疗骨关节炎中的应用及兔膝骨关节炎造模方法[J].中国生化药物杂志，2007，28（4）：283-285.
[5] Kerr JFR， Searle J. Deletion of cells by apoptosis during castration[J]. Vir-chow Arch B，1973，13：87.
[6] 朱永磊.针刺对细胞凋亡的影响[J].中医药临床杂志，2007，19（2）：102-104.
（收稿日期：2012-05-02，编辑：华强）