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摘要：目的 观察脑康Ⅱ号对糖尿病大鼠学习记忆功能的干预情况，探讨其作用机制。方法 采用链脲佐菌素腹腔注射造模，随机分为模型组及脑康Ⅱ号大、中、小剂量组，另取10只作为对照组。造模后第2日给药组使用脑康Ⅱ号对糖尿病大鼠进行干预，持续3 d。采用水迷宫实验和气相色谱-质谱联用仪，分别观察糖尿病大鼠的行为学改变和血清甲基乙二醛的变化。结果 脑康Ⅱ号能够显著缩短大鼠Morris水迷宫到达站台时间，并降低大鼠血清甲基乙二醛的水平。结论 脑康Ⅱ号能够通过降低大鼠血清甲基乙二醛的水平，改善糖尿病大鼠认知障碍。
关键词：脑康Ⅱ号；糖尿病；认知障碍；甲基乙二醛；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0031-03
随着人口老龄化进程的加快，糖尿病已成为全球面临的严重社会问题。糖尿病糖代谢紊乱可以在结构、神经生理、神经精神等诸多方面对大脑产生不良影响。研究表明，糖尿病患者存在某些方面的认知障碍，特别是其学习、记忆能力受损[1]。而对于中老年人来说，轻微的认知功能减退即可显著增加发生老年痴呆的危险[2]。本研究应用以补髓益智、活血化痰立法的中药脑康Ⅱ号对糖尿病认知障碍大鼠进行干预，观察糖尿病认知障碍大鼠的行为学、海马神经细胞凋亡和血清MG的变化，以研究中药治疗糖尿病认知障碍的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
3月龄雄性Wistar大鼠，SPF级，体质量180～200 g，北京维通利华实验动物技术公司提供，许可证号：SCXK（京）2002- 0003。
1.2 药物
脑康Ⅱ号由制何首乌、熟地黄、三七、石菖蒲等组成，参
基金项目：国家自然科学基金（81041022）；北京市自然科学基金（7102073）；北京市科技新星项目（2008A090）
通讯作者：黄小波，E-mail：huangxiaobo@bjgn.org
照2010年版《中华人民共和国药典》，确定原药材产地，炮制方法，委托本院中药制剂室进行加工，并对pH值、比重、卫生学等进行检测。按成人用量的20、10、5倍比例分成大、中、小3个剂量组，以恒温水浴锅分别浓缩成含原药材2.0、1.0、0.5 g/mL，消毒玻璃瓶密闭盛装，保存于4 ℃冰箱备用，保存时间不超过1周。用前摇匀。
1.3 试剂和仪器
链脲佐菌素（STZ），MG标准品和蛋白酶K均购自Sigma公司。One-Touch-Ⅱ快速血糖仪及血糖试纸购自强生公司。Morris水迷宫及分析软件（中国医学科学院药物研究所）。气相色谱-质谱联用仪（Shimadzu QP2010 Plus）；色谱柱（DB-5， 30 m×0.25 mm×0.25 ?m）；电子天平（CP225D，Sartorius）；氮吹仪（N-EAVPTML11，Organomation Associates，Inc.）。
2 实验方法
2.1 分组和给药
使用随机数字表法分组。对照组：正常大鼠；模型组：糖尿病模型大鼠；脑康Ⅱ号干预组（分为大、中、小剂量3组）：造模后第2日灌胃中药，持续30 d。每周检测大鼠血糖1次。
2.2 造模
除对照组外，大鼠造模前禁食不禁水12 h，用0.1 mol/L新鲜枸橼酸缓冲液（pH 4.4）配制STZ 10 mg/mL，按60 mg/kg剂量腹腔注射。对照组注射等体积枸橼酸缓冲液。3 d后用快速血糖仪测尾血，非禁食血糖>15 mmol/L为糖尿病模型成立。
2.3 Morris水迷宫实验
由圆形水池和自动摄像及电脑分析系统组成。水池上方的摄像机同步记录大鼠的运动轨迹。水深30 cm，水温控制在22～25 ℃之间。动物头朝池壁入水，120 s未找到站台者，将其引至站台，放置30 s引导其学习与记忆，共进行5 d，前4 d为训练时间，第5日为测试。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。实验结束后记录各动物的到达站台的游动时间及距离、初始角度、搜索站台的轨迹。
2.4 血清甲基乙二醛检测
大鼠经腹主动脉采血，3 000 r/min离心，取上清冻存备用。移取200 ?L血清于1.5 mL试管中，加入5 ?L 0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），10 ?L 20 mg/mL蛋白酶K，200 ?L乙腈，充分混匀，15 000 r/min离心后分离有机相，加入适量盐酸（pH=3），再加入50 ?L 25 mg/mL乙醛标准品（PFBOA）衍生试剂，充分混匀。50 ℃下反应2 h。加入0.5 g NaCl，混匀，然后再加入3 mL乙醚-正己烷（1∶1），充分混匀，离心除去有机相，置于一洁净试管中（管A），加入3 mL乙酸乙酯进行第2次提取，同上步骤混匀离心。分离出有机相，置于管A中与第1次提取物混合，混合物随即冷却，进行气相色谱-质谱分析，记录色谱图。
3 统计学方法
采用SPSS12.0统计软件进行分析，数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，组内比较使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
5 讨论
糖尿病认知障碍的发病机制目前还没有完全明确，但已发现与大脑缺血、氧化应激、非酶糖基化、胰岛素的不良反应及钙离子稳态的改变等有关[3]。糖尿病高血糖导致的MG在体内蓄积，一方面可以通过生成晚期糖基化终产物而导致海马神经元退化或凋亡[4]；另一方面，MG自身具有较强的细胞毒性和其他生物活性，可以直接作用于海马神经元，发生病理生物学作用[5]，因而在糖尿病认知障碍发病过程中具有重要的意义。 糖尿病认知障碍以学习、记忆障碍为主要临床表现，病位在脑，脑居颅内，由髓汇集而成，髓海不足为其根本原因。同时，消渴患者，阴液亏虚，虚火内炽，炼液成痰，痰阻经络，血行不畅，而致痰瘀互阻，蒙蔽清窍。因此，糖尿病认知障碍以精髓亏虚、痰瘀互阻为基本病机[6]。基于此，我们以补髓益智、活血化痰为法，研制了脑康Ⅱ号，方中制何首乌、熟地黄补髓益智，三七活血化瘀，石菖蒲开窍化痰，用于干预糖尿病因肾精亏损、脑髓失养、痰瘀互阻而致的认知障碍。本研究使用脑康Ⅱ号对糖尿病大鼠进行干预，在Morris水迷宫实验中发现脑康Ⅱ号能够显著缩短大鼠到达站台时间，表明脑康Ⅱ号能够改善糖尿病大鼠的认知障碍。糖尿病大鼠血清MG含量显著升高，这可能是因为血糖水平升高促进Maillard反应和多元醇途径生成MG[7]；同时乙二醛酶活性下降则导致乙二醛酶Ⅰ对MG的代谢功能减退[8]；另外，糖尿病时机体处于氧化应激状态，体内高水平的活性氧中间产物可能刺激细胞产生MG[9]，最终导致血清中MG生成显著增加[10]。而脑康Ⅱ号能够有效降低血清MG水平，进而减轻MG在体内的神经毒性，这可能是其能够改善糖尿病大鼠认知功能的原因之一。由于糖尿病认知障碍可以由多种原因引起，而中药复方则具有多成分、多靶点的药理作用特点，各有效成分通过多种药理途径和药效靶点，发挥防治疾病的作用。因此，有必要进一步开展研究，从不同角度深入分析脑康Ⅱ号干预糖尿病认知障碍的作用机制。
参考文献：
[1] Debling D， Amelang M， Hasselbach P， et al. Diabetes and cognitive function in a population-based study of elderly women and men[J]. J Diabetes Complications，2006，20（4）：238-245.
[2] Fischer P， Jungwirth S， Zehetmayer S， et al. Conversion from subtypes of mild cognitive impairment to Alzheimer dementia[J]. Neurology，2007，68（4）：288-291.
[3] Sima AA， Kamiya H， Li ZG. Insulin， C-peptide， hyperglycemia， and central nervous system complications in diabetes[J]. Eur J Pharmacol，2004，490（1-3）：187-197.
[4] Sato T， Shimogaito N， Wu X， et al. Toxic advanced glycation end products （TAGE） theory in Alzheimer's disease[J]. Am J Alzheimers Dis Other Demen，2006，21（3）：197-208.
[5] Di Loreto S， Caracciolo V， Colafarina S， et al. Methylglyoxal induces oxidative stress-dependent cell injury and up-regulation of interleukin-1beta and nerve growth factor in cultured hippocampal neuronal cells[J]. Brain Res， 2004，1006（2）：157-167.
[6] 黄小波，李宗信，陈文强，等.2型糖尿病认知障碍的中医证候聚类分型[J].中国中西医结合急救杂志，2009，16（1）：11-13.
[7] Thornalley PJ， Anngborg A， Minhas HS. Formation of glyoxal， methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose[J]. Biochem J，1999，344（1）：109-116.
[8] Miller AG， Smith DG， Bhat M，et al. Glyoxalase Ⅰ is critical for human retinal capillary pericyte survival under hyperglycemic
conditions[J]. J Biol Chem，2006，281（17）：11864-11871.
[9] Beisswenger PJ， Drummond KS， Nelson RG， et al. Susceptibility to diabetic nephropathy is related to dicarbonyl and oxidative stress[J]. Diabetes，2005，54（11）：3274-3281.
[10] Odani H， Shinzato T， Matsumoto Y， et al. Increase in three alpha，beta-dicarbonyl compound levels in human uremic plasma：specific in vivo determination of intermediates in advanced Maillard reaction[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，256（1）：89-93.
（收稿日期：2011-12-25，编辑：华强）
关键词：脑康Ⅱ号；糖尿病；认知障碍；甲基乙二醛；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.11.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）11-0031-03
随着人口老龄化进程的加快，糖尿病已成为全球面临的严重社会问题。糖尿病糖代谢紊乱可以在结构、神经生理、神经精神等诸多方面对大脑产生不良影响。研究表明，糖尿病患者存在某些方面的认知障碍，特别是其学习、记忆能力受损[1]。而对于中老年人来说，轻微的认知功能减退即可显著增加发生老年痴呆的危险[2]。本研究应用以补髓益智、活血化痰立法的中药脑康Ⅱ号对糖尿病认知障碍大鼠进行干预，观察糖尿病认知障碍大鼠的行为学、海马神经细胞凋亡和血清MG的变化，以研究中药治疗糖尿病认知障碍的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
3月龄雄性Wistar大鼠，SPF级，体质量180～200 g，北京维通利华实验动物技术公司提供，许可证号：SCXK（京）2002- 0003。
1.2 药物
脑康Ⅱ号由制何首乌、熟地黄、三七、石菖蒲等组成，参
基金项目：国家自然科学基金（81041022）；北京市自然科学基金（7102073）；北京市科技新星项目（2008A090）
通讯作者：黄小波，E-mail：huangxiaobo@bjgn.org
照2010年版《中华人民共和国药典》，确定原药材产地，炮制方法，委托本院中药制剂室进行加工，并对pH值、比重、卫生学等进行检测。按成人用量的20、10、5倍比例分成大、中、小3个剂量组，以恒温水浴锅分别浓缩成含原药材2.0、1.0、0.5 g/mL，消毒玻璃瓶密闭盛装，保存于4 ℃冰箱备用，保存时间不超过1周。用前摇匀。
1.3 试剂和仪器
链脲佐菌素（STZ），MG标准品和蛋白酶K均购自Sigma公司。One-Touch-Ⅱ快速血糖仪及血糖试纸购自强生公司。Morris水迷宫及分析软件（中国医学科学院药物研究所）。气相色谱-质谱联用仪（Shimadzu QP2010 Plus）；色谱柱（DB-5， 30 m×0.25 mm×0.25 ?m）；电子天平（CP225D，Sartorius）；氮吹仪（N-EAVPTML11，Organomation Associates，Inc.）。
2 实验方法
2.1 分组和给药
使用随机数字表法分组。对照组：正常大鼠；模型组：糖尿病模型大鼠；脑康Ⅱ号干预组（分为大、中、小剂量3组）：造模后第2日灌胃中药，持续30 d。每周检测大鼠血糖1次。
2.2 造模
除对照组外，大鼠造模前禁食不禁水12 h，用0.1 mol/L新鲜枸橼酸缓冲液（pH 4.4）配制STZ 10 mg/mL，按60 mg/kg剂量腹腔注射。对照组注射等体积枸橼酸缓冲液。3 d后用快速血糖仪测尾血，非禁食血糖>15 mmol/L为糖尿病模型成立。
2.3 Morris水迷宫实验
由圆形水池和自动摄像及电脑分析系统组成。水池上方的摄像机同步记录大鼠的运动轨迹。水深30 cm，水温控制在22～25 ℃之间。动物头朝池壁入水，120 s未找到站台者，将其引至站台，放置30 s引导其学习与记忆，共进行5 d，前4 d为训练时间，第5日为测试。数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。实验结束后记录各动物的到达站台的游动时间及距离、初始角度、搜索站台的轨迹。
2.4 血清甲基乙二醛检测
大鼠经腹主动脉采血，3 000 r/min离心，取上清冻存备用。移取200 ?L血清于1.5 mL试管中，加入5 ?L 0.1%十二烷基硫酸钠（SDS），10 ?L 20 mg/mL蛋白酶K，200 ?L乙腈，充分混匀，15 000 r/min离心后分离有机相，加入适量盐酸（pH=3），再加入50 ?L 25 mg/mL乙醛标准品（PFBOA）衍生试剂，充分混匀。50 ℃下反应2 h。加入0.5 g NaCl，混匀，然后再加入3 mL乙醚-正己烷（1∶1），充分混匀，离心除去有机相，置于一洁净试管中（管A），加入3 mL乙酸乙酯进行第2次提取，同上步骤混匀离心。分离出有机相，置于管A中与第1次提取物混合，混合物随即冷却，进行气相色谱-质谱分析，记录色谱图。
3 统计学方法
采用SPSS12.0统计软件进行分析，数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，组内比较使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
5 讨论
糖尿病认知障碍的发病机制目前还没有完全明确，但已发现与大脑缺血、氧化应激、非酶糖基化、胰岛素的不良反应及钙离子稳态的改变等有关[3]。糖尿病高血糖导致的MG在体内蓄积，一方面可以通过生成晚期糖基化终产物而导致海马神经元退化或凋亡[4]；另一方面，MG自身具有较强的细胞毒性和其他生物活性，可以直接作用于海马神经元，发生病理生物学作用[5]，因而在糖尿病认知障碍发病过程中具有重要的意义。 糖尿病认知障碍以学习、记忆障碍为主要临床表现，病位在脑，脑居颅内，由髓汇集而成，髓海不足为其根本原因。同时，消渴患者，阴液亏虚，虚火内炽，炼液成痰，痰阻经络，血行不畅，而致痰瘀互阻，蒙蔽清窍。因此，糖尿病认知障碍以精髓亏虚、痰瘀互阻为基本病机[6]。基于此，我们以补髓益智、活血化痰为法，研制了脑康Ⅱ号，方中制何首乌、熟地黄补髓益智，三七活血化瘀，石菖蒲开窍化痰，用于干预糖尿病因肾精亏损、脑髓失养、痰瘀互阻而致的认知障碍。本研究使用脑康Ⅱ号对糖尿病大鼠进行干预，在Morris水迷宫实验中发现脑康Ⅱ号能够显著缩短大鼠到达站台时间，表明脑康Ⅱ号能够改善糖尿病大鼠的认知障碍。糖尿病大鼠血清MG含量显著升高，这可能是因为血糖水平升高促进Maillard反应和多元醇途径生成MG[7]；同时乙二醛酶活性下降则导致乙二醛酶Ⅰ对MG的代谢功能减退[8]；另外，糖尿病时机体处于氧化应激状态，体内高水平的活性氧中间产物可能刺激细胞产生MG[9]，最终导致血清中MG生成显著增加[10]。而脑康Ⅱ号能够有效降低血清MG水平，进而减轻MG在体内的神经毒性，这可能是其能够改善糖尿病大鼠认知功能的原因之一。由于糖尿病认知障碍可以由多种原因引起，而中药复方则具有多成分、多靶点的药理作用特点，各有效成分通过多种药理途径和药效靶点，发挥防治疾病的作用。因此，有必要进一步开展研究，从不同角度深入分析脑康Ⅱ号干预糖尿病认知障碍的作用机制。
参考文献：
[1] Debling D， Amelang M， Hasselbach P， et al. Diabetes and cognitive function in a population-based study of elderly women and men[J]. J Diabetes Complications，2006，20（4）：238-245.
[2] Fischer P， Jungwirth S， Zehetmayer S， et al. Conversion from subtypes of mild cognitive impairment to Alzheimer dementia[J]. Neurology，2007，68（4）：288-291.
[3] Sima AA， Kamiya H， Li ZG. Insulin， C-peptide， hyperglycemia， and central nervous system complications in diabetes[J]. Eur J Pharmacol，2004，490（1-3）：187-197.
[4] Sato T， Shimogaito N， Wu X， et al. Toxic advanced glycation end products （TAGE） theory in Alzheimer's disease[J]. Am J Alzheimers Dis Other Demen，2006，21（3）：197-208.
[5] Di Loreto S， Caracciolo V， Colafarina S， et al. Methylglyoxal induces oxidative stress-dependent cell injury and up-regulation of interleukin-1beta and nerve growth factor in cultured hippocampal neuronal cells[J]. Brain Res， 2004，1006（2）：157-167.
[6] 黄小波，李宗信，陈文强，等.2型糖尿病认知障碍的中医证候聚类分型[J].中国中西医结合急救杂志，2009，16（1）：11-13.
[7] Thornalley PJ， Anngborg A， Minhas HS. Formation of glyoxal， methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose[J]. Biochem J，1999，344（1）：109-116.
[8] Miller AG， Smith DG， Bhat M，et al. Glyoxalase Ⅰ is critical for human retinal capillary pericyte survival under hyperglycemic
conditions[J]. J Biol Chem，2006，281（17）：11864-11871.
[9] Beisswenger PJ， Drummond KS， Nelson RG， et al. Susceptibility to diabetic nephropathy is related to dicarbonyl and oxidative stress[J]. Diabetes，2005，54（11）：3274-3281.
[10] Odani H， Shinzato T， Matsumoto Y， et al. Increase in three alpha，beta-dicarbonyl compound levels in human uremic plasma：specific in vivo determination of intermediates in advanced Maillard reaction[J]. Biochem Biophys Res Commun，1999，256（1）：89-93.
（收稿日期：2011-12-25，编辑：华强）