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摘要：目的 建立咽炎方含片高效液相色谱（HPLC）指纹图谱。方法 采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，检测波长203 nm，柱温为室温，流速1.0 mL/min。结果 该色谱条件下咽炎方含片各成分得到了较好的分离，标准指纹图谱由9个特征峰组成。10个批次的样品指纹图谱相似度为0.8586～0.9902。结论 HPLC 指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，可用于咽炎方含片的质量控制。
关键词：咽炎方含片；指纹图谱；高效液相色谱法
咽炎方含片由广东土牛膝、岗梅根和甘草组成，用于治疗急慢性咽炎、咽喉肿痛、扁桃体炎，是中山大学附属第一医院临床应用多年的经验方。方中广东土牛膝、岗梅根均为广东地产药材，其化学成分、尤其是有效成分或标志性化合物尚未明确，给有效控制及评价该制剂的质量带来了一定的困难。鉴于指纹图谱技术是一种多组分复杂样品质量评价的有效方法，本试验拟建立该制剂的中药高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，以便更全面地控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
Waters 515液相色谱仪，AL204型电子天平（瑞士METTLER- TOLEDO公司）。
甘草苷对照品（批号111610-200604）购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。咽炎方含片样品为中山大学附属第一医院药学部自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为：0～30 min， 85%～75%A；30～40 min，75%～65%A；40～50 min，65%～85%A；50～60 min，85%A。检测波长为203 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min。
基金项目：广东省重大科技专项（2011A080300004）
通讯作者：任斌，E-mail：renbinsys@sina.com
2.2 供试品溶液的制备
取20 片咽炎方含片，研细，取约6.0 g 片粉，精密称定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇至90 mL，超声（1 200 W，20 kHz）处理15 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]。
2.3 方法学验证
2.3.1 精密度试验 取同一批号（20100201）样品，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下，重复进样5次，记录指纹图谱。结果各色谱峰对参照峰（7号峰，甘草苷）相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于4.0%，符合指纹图谱要求。
2.3.2 重复性试验 取同一批号（20100201）样品5份，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3.6%，符合指纹图谱要求。
2.3.3 稳定性试验 取同一批号（20100201）样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于2.7%。结果表明，咽炎方含片样品溶液在24 h内稳定。
2.4 指纹图谱的建立
2.4.1 特征峰的确定 在上述色谱条件下，测定10批咽炎方含片，记录图谱。对10批供试品结果进行分析比较，标定了9个共有指纹峰，典型色谱图见图1。2、4、6号峰来源于广东土牛膝，1、5、9号峰来源于岗梅根，3、7、8号峰来源于甘草。
2.4.2 参照峰的选择 保留时间为25.1 min的7号色谱峰峰面积较大，出峰时间适中且稳定，经标准品对照认定为甘草苷的吸收峰，因此选择甘草苷作为HPLC指纹图谱的参照峰，以其保留时间和峰面积为1.0，计算各批指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。
2.4.3 相似度分析 采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（版本2004 A），对10批咽炎方含片的指纹图谱进行分析，以色谱峰的平均值建立对照指纹图谱，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，结果见表3。
3 讨论
本研究考察了3种不同型号色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamond C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果表明， Phenomenex Luna C18柱分离出的色谱峰分离度好、峰数多、稳定性好。故选择 Phenomenex Luna C18柱为分析色谱柱。
试验发现，采用常规的水浴（50 ℃）搅拌法，咽炎方含片完全溶解需40 min，而采用50%甲醇超声处理，只需15 min即可完全溶解。超声处理法不但能加快含片的溶解速度，省时、节能，最主要的是能避免加热导致的热敏成分的破坏。因此采用50%甲醇超声处理15 min来溶解咽炎方含片。
咽炎方含片中岗梅根主要含有皂苷类成分，紫外吸收波长短。为使各被测组分均有较大吸收，选用203 nm为指纹图谱检测波长[2]。比较乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水溶液系统下的色谱图，结果乙腈-磷酸水溶液系统梯度洗脱的柱压较低，流动相的改变对其基线影响较小。
各批次药材的来源、质量对指纹图谱有明显影响。根据相似度分析结果，结合色谱峰面积相对于称样量与平均片重量化，相似度在0.90以上的样品质量较好，0.90以下的为质量较差[3]。批次2、3、4、6、7、8、9、10样品指纹图谱相似度为0.949 0～0.990 2，说明各批次咽炎方含片之间具有较好的相似性，样品质量较好，而批次1、5样品指纹图谱相似度小于0.90，说明质量较差。
本试验建立了咽炎方含片的HPLC指纹图谱，确定了9个共有峰，计算了10 批咽炎方含片的指纹图谱的相似度。同时，本试验明确了9个共有峰的原药材归属，为咽炎方含片的定量指标的选择和确定提供了参考。本试验建立的咽炎方含片指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，为咽炎方含片的质量控制奠定了基础。
参考文献：
[1] 韦炳华，李瑞明，卢进，等.咽炎方含片的制备工艺研究[J].今日药学， 2012，22（5）：272-273.
[2] 卢进，任斌，陈孝.广东岗梅药材的HPLC指纹图谱研究[J].热带医学杂志，2011，11（5）：550-552.
[3] 王云龙，李延雪，邵礼梅，等.元胡止痛片HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2011，42（3）：495-497.
（收稿日期：2012-07-24，编辑：陈静）
关键词：咽炎方含片；指纹图谱；高效液相色谱法
咽炎方含片由广东土牛膝、岗梅根和甘草组成，用于治疗急慢性咽炎、咽喉肿痛、扁桃体炎，是中山大学附属第一医院临床应用多年的经验方。方中广东土牛膝、岗梅根均为广东地产药材，其化学成分、尤其是有效成分或标志性化合物尚未明确，给有效控制及评价该制剂的质量带来了一定的困难。鉴于指纹图谱技术是一种多组分复杂样品质量评价的有效方法，本试验拟建立该制剂的中药高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，以便更全面地控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
Waters 515液相色谱仪，AL204型电子天平（瑞士METTLER- TOLEDO公司）。
甘草苷对照品（批号111610-200604）购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。咽炎方含片样品为中山大学附属第一医院药学部自制。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为0.2%磷酸溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为：0～30 min， 85%～75%A；30～40 min，75%～65%A；40～50 min，65%～85%A；50～60 min，85%A。检测波长为203 nm，柱温为室温，流速为1.0 mL/min。
基金项目：广东省重大科技专项（2011A080300004）
通讯作者：任斌，E-mail：renbinsys@sina.com
2.2 供试品溶液的制备
取20 片咽炎方含片，研细，取约6.0 g 片粉，精密称定，置100 mL量瓶中，加50%甲醇至90 mL，超声（1 200 W，20 kHz）处理15 min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[1]。
2.3 方法学验证
2.3.1 精密度试验 取同一批号（20100201）样品，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下，重复进样5次，记录指纹图谱。结果各色谱峰对参照峰（7号峰，甘草苷）相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于4.0%，符合指纹图谱要求。
2.3.2 重复性试验 取同一批号（20100201）样品5份，按“2.2”项下方法操作，在上述色谱条件下进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于3.6%，符合指纹图谱要求。
2.3.3 稳定性试验 取同一批号（20100201）样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，于室温下放置，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，其RSD值均小于2.7%。结果表明，咽炎方含片样品溶液在24 h内稳定。
2.4 指纹图谱的建立
2.4.1 特征峰的确定 在上述色谱条件下，测定10批咽炎方含片，记录图谱。对10批供试品结果进行分析比较，标定了9个共有指纹峰，典型色谱图见图1。2、4、6号峰来源于广东土牛膝，1、5、9号峰来源于岗梅根，3、7、8号峰来源于甘草。
2.4.2 参照峰的选择 保留时间为25.1 min的7号色谱峰峰面积较大，出峰时间适中且稳定，经标准品对照认定为甘草苷的吸收峰，因此选择甘草苷作为HPLC指纹图谱的参照峰，以其保留时间和峰面积为1.0，计算各批指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。
2.4.3 相似度分析 采用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（版本2004 A），对10批咽炎方含片的指纹图谱进行分析，以色谱峰的平均值建立对照指纹图谱，利用相关系数法计算指纹图谱的相似度，结果见表3。
3 讨论
本研究考察了3种不同型号色谱柱：Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamond C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。结果表明， Phenomenex Luna C18柱分离出的色谱峰分离度好、峰数多、稳定性好。故选择 Phenomenex Luna C18柱为分析色谱柱。
试验发现，采用常规的水浴（50 ℃）搅拌法，咽炎方含片完全溶解需40 min，而采用50%甲醇超声处理，只需15 min即可完全溶解。超声处理法不但能加快含片的溶解速度，省时、节能，最主要的是能避免加热导致的热敏成分的破坏。因此采用50%甲醇超声处理15 min来溶解咽炎方含片。
咽炎方含片中岗梅根主要含有皂苷类成分，紫外吸收波长短。为使各被测组分均有较大吸收，选用203 nm为指纹图谱检测波长[2]。比较乙腈-磷酸水溶液和甲醇-磷酸水溶液系统下的色谱图，结果乙腈-磷酸水溶液系统梯度洗脱的柱压较低，流动相的改变对其基线影响较小。
各批次药材的来源、质量对指纹图谱有明显影响。根据相似度分析结果，结合色谱峰面积相对于称样量与平均片重量化，相似度在0.90以上的样品质量较好，0.90以下的为质量较差[3]。批次2、3、4、6、7、8、9、10样品指纹图谱相似度为0.949 0～0.990 2，说明各批次咽炎方含片之间具有较好的相似性，样品质量较好，而批次1、5样品指纹图谱相似度小于0.90，说明质量较差。
本试验建立了咽炎方含片的HPLC指纹图谱，确定了9个共有峰，计算了10 批咽炎方含片的指纹图谱的相似度。同时，本试验明确了9个共有峰的原药材归属，为咽炎方含片的定量指标的选择和确定提供了参考。本试验建立的咽炎方含片指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，为咽炎方含片的质量控制奠定了基础。
参考文献：
[1] 韦炳华，李瑞明，卢进，等.咽炎方含片的制备工艺研究[J].今日药学， 2012，22（5）：272-273.
[2] 卢进，任斌，陈孝.广东岗梅药材的HPLC指纹图谱研究[J].热带医学杂志，2011，11（5）：550-552.
[3] 王云龙，李延雪，邵礼梅，等.元胡止痛片HPLC指纹图谱研究[J].中草药，2011，42（3）：495-497.
（收稿日期：2012-07-24，编辑：陈静）