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摘要：探讨实时荧光PCR法检测乙肝病毒DNA在临床中的应用。针对200例临床乙肝病毒携带者的血清标本用ELISA法进行定性检测，再用实时荧光PCR定量检测，对两种检测结果进行相关性分析。得出PCR定量测定HBV-DNA可以真实地反映体内乙肝病毒感染和复制及病毒载量情况，更有利于临床治疗和疗效的观察。并且实时荧光PCR法检测HBV-DNA具有快速、准确等优点，而且对低复制持续感染乙肝病人也能诊断。
关键词：荧光PCR;血清标志物;HBV-DNA
乙肝是目前世界上最常见、最广泛、危害最严重的病毒性肝炎之一，据世界卫生组织估计，此病已造成世界上大约每年总共100万多人死亡[1]。慢性乙肝携带者占世界总人口的10% 以上，急性乙肝中有20%会转为慢性，进而发展为肝硬化和肝癌。因此，准确、快速诊断对乙肝的治疗和预后极为重要。但目前随着乙肝模式的复杂化，临床上对患者的HBV感染复制情况难以判断，有时甚至出现漏诊。HBV-DNA是直接反应乙肝病毒存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标，荧光定量PCR法在进行HBV-DNA检测的同时，可以对其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内的HBV复制以及传染性有更直接的了解，同时也更有利于临床诊断HBV感染、选择治疗方案及判断预后。
1 材料与方法
1.1 标本来源 300例标本均来自2014年6月1日-6月30日我院感染科的病人及本院体检者中发现的乙型肝炎患者，其中男180例，女120例，15～79岁，平均为47岁。
1.2 试剂和仪器 乙肝血清标志物检测试剂盒来自上海科华生物工程股份有限公司HBV-DNA试剂购于中山大学达安基因股份有限公司;酶标仪为ST-360酶标仪。
1.3 检测方法ELISA法：按检测试剂盒说明书操作，乙肝标志物检测项顺序设定为HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb;PCR定量检测：采用核酸扩增实时荧光检测，完全按试剂盒说明书操作。
1.4 统计学处理采用χ2检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
从检测可见，在检测出的14种乙肝模式中，“小三阳”组和1，5项阳性组HBV-DNA的阳性检出率以及拷贝数均低于“大三阳”组（P<0.05）。10例1，3项阳性的HBV-DNA的阳性检出率为60.00%（6/10），拷贝数为（1.39±0.57）×103 /ml;7例1，3，4，5项阳性的HBV-DNA阳性率是57.14%，DNA拷贝数为（1.05±0.99）×105/ml，说明这两种模式的病毒仍有很强的复制性。2例1，2，4，5项阳性标本中，DNA的阳性检出率是100%，拷贝数为（1.1±0.60）×103 /ml，说明即使表面抗体出现阳性，但仍有病毒在体内复制。（见表1）
表1 300例乙肝患者乙肝病毒检测结果
检测例数
血清学标志物模式（项）
HBV-DNA阳性率%（n）
拷贝数
PreS1-Ag阳性率%（n）
35
1，3，5
97.14（34）
（4.69±1.9）×107 /ml
97.14（34）
196
1，4，5
35.20（69）
（3.68±1.76）×105 /ml
33.16（65）
30
1，5
43.33（13）
（1.92±1.21）×104/ml
40.00（12）
10
1，3
60.00（6）
（1.39±0.57）×103 /ml
100.00（10）
7
1，3，4，5
28.57（4）
（1.05±0.99）×105/ml
28.57（4）
2
1，2，4，5
100.00（2）
（1.1±0.60）×103 /ml
100.00（2）
1
1，2，5
0
0
1
1，4
0
0
3
1，2，3，5
0
0
8
4，5
0
0
1
4
0
0
4
5
0
0
1
3，5
0
0
1
2，4
0
0
3 讨论
本研究结果显示，35例“大三阳”中，34例检出HBV-DNA阳性，HBV-DNA阳性率为97.14%，平均拷贝数为（4.69±1.9）×107 /ml，说明患者存在较高的拷贝量;经统计学检验，“大三阳”的拷贝数比“小三阳”组高（P<0.05），说明这些患者具有较高的复制水平，是具有传染性的重要标志。而且在“大三阳”、“小三阳”2种不同情况中，其血清HBV-DNA载量不同，反映体内HBV复制的活跃程度不同，因而HBV-DNA的含量变化与HBV血清标志物的变化基本相一致[2，3]。 196例“小三阳”中，69例检出HBV-DNA阳性，其阳性率为35.20%，拷贝数为（3.68±1.76）×105 /ml。阳性率虽然小于“大三阳”组，但该组病人仍然具有很高的病毒复制，传染性强，说明HbeAb阳性并不表示患者体内没有病毒复制。30例l，5项阳性的血清中，有13例检出HBV-DNA阳性，阳性率为43.33%，其拷贝数为（1.92±1.21）×104/ml，提示该组病人仍具有很强的病毒复制，传染性强，此情况可能为血清转换期或前c区突变。2例1，2，4，5项阳性的HBV-DNA的阳性检出率为100%，PreS -Ag的阳性率为100%，拷贝数为（1.0±0.54）×10 3/rnl，说明患者虽然出现了HbsAb（+），但体内仍有病毒在复制，HbsAb（+）和HbeAg转阴并不意味着病毒的复制停止或减弱。有学者认为，此现象可能与HBV-DNA前C区发生突变有关，出现“免疫逃避”或不同亚型的HBV重叠感染[4]。也有学者证明，乙型肝炎HbsAb（+）出现后，血清内仍有DNA复制，随着时间的推移，HBV-DNA的检出逐渐下降。定量PCR可检测出病人血液中病毒的拷贝数，从而了解病毒在体内复制的动态情况，判断病情、观察疗效、适时调整治疗方案，还可以决定乙肝治疗的终点，用于乙肝病毒变异株的检测，作为肝炎病毒复制的直接实验室依据，具有判断病毒携带者是否具传染性等优点。
ELISA法检测血清HBV标志物是临床诊断HBV感染的传统手段，它检测的是人体对HBV的免疫反应状态，只能定性，而不能定量判断病毒的载量情况。而荧光定量PCR则可以准确地反应出HBV-DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等，由此可见，PCR定量检测乙肝病毒有更大的优势。综上所述，检测HBV-DNA作为判断乙肝患者是否具有传染性，为乙肝患者合理治疗提供了依据，定量PCR检测HBV-DNA在判断体内HBV是否在复制、复制程度、HBV是否被清除等方面有重要作用，而且为临床观察药物疗效、病情转化等提供了有力的依据。
参考文献：
[1]张蓓，杨晓云，刘蕊，等.荧光定量PCR检测HBV—DNA与乙肝两对半检测结果的相关性讨论[J].河北医学杂志，2006，9：835 —838.
[2]尤平涛，王宁红.乙肝两对半模式与乙肝DNA关系的探讨[J].医学动物防制，2006，9：680-682.
[3]何印蕾.实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J].实用医技杂志，2006，22：3954-3955.
[4]邹享珍.前s1抗原与乙型肝炎病毒血清学标志物同时检测的临床意义[J].临床和实验医学杂志，2007，3：87—87.
[5]郭亚光，楼大勇.乙肝前s1抗原与HBV-DNA、HbeAg（HBeAb）相关性的研究[J].安徽医药，2007，5：444.
关键词：荧光PCR;血清标志物;HBV-DNA
乙肝是目前世界上最常见、最广泛、危害最严重的病毒性肝炎之一，据世界卫生组织估计，此病已造成世界上大约每年总共100万多人死亡[1]。慢性乙肝携带者占世界总人口的10% 以上，急性乙肝中有20%会转为慢性，进而发展为肝硬化和肝癌。因此，准确、快速诊断对乙肝的治疗和预后极为重要。但目前随着乙肝模式的复杂化，临床上对患者的HBV感染复制情况难以判断，有时甚至出现漏诊。HBV-DNA是直接反应乙肝病毒存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标，荧光定量PCR法在进行HBV-DNA检测的同时，可以对其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内的HBV复制以及传染性有更直接的了解，同时也更有利于临床诊断HBV感染、选择治疗方案及判断预后。
1 材料与方法
1.1 标本来源 300例标本均来自2014年6月1日-6月30日我院感染科的病人及本院体检者中发现的乙型肝炎患者，其中男180例，女120例，15～79岁，平均为47岁。
1.2 试剂和仪器 乙肝血清标志物检测试剂盒来自上海科华生物工程股份有限公司HBV-DNA试剂购于中山大学达安基因股份有限公司;酶标仪为ST-360酶标仪。
1.3 检测方法ELISA法：按检测试剂盒说明书操作，乙肝标志物检测项顺序设定为HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb;PCR定量检测：采用核酸扩增实时荧光检测，完全按试剂盒说明书操作。
1.4 统计学处理采用χ2检验进行统计学处理，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
从检测可见，在检测出的14种乙肝模式中，“小三阳”组和1，5项阳性组HBV-DNA的阳性检出率以及拷贝数均低于“大三阳”组（P<0.05）。10例1，3项阳性的HBV-DNA的阳性检出率为60.00%（6/10），拷贝数为（1.39±0.57）×103 /ml;7例1，3，4，5项阳性的HBV-DNA阳性率是57.14%，DNA拷贝数为（1.05±0.99）×105/ml，说明这两种模式的病毒仍有很强的复制性。2例1，2，4，5项阳性标本中，DNA的阳性检出率是100%，拷贝数为（1.1±0.60）×103 /ml，说明即使表面抗体出现阳性，但仍有病毒在体内复制。（见表1）
表1 300例乙肝患者乙肝病毒检测结果
检测例数
血清学标志物模式（项）
HBV-DNA阳性率%（n）
拷贝数
PreS1-Ag阳性率%（n）
35
1，3，5
97.14（34）
（4.69±1.9）×107 /ml
97.14（34）
196
1，4，5
35.20（69）
（3.68±1.76）×105 /ml
33.16（65）
30
1，5
43.33（13）
（1.92±1.21）×104/ml
40.00（12）
10
1，3
60.00（6）
（1.39±0.57）×103 /ml
100.00（10）
7
1，3，4，5
28.57（4）
（1.05±0.99）×105/ml
28.57（4）
2
1，2，4，5
100.00（2）
（1.1±0.60）×103 /ml
100.00（2）
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1，2，5
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1
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0
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3 讨论
本研究结果显示，35例“大三阳”中，34例检出HBV-DNA阳性，HBV-DNA阳性率为97.14%，平均拷贝数为（4.69±1.9）×107 /ml，说明患者存在较高的拷贝量;经统计学检验，“大三阳”的拷贝数比“小三阳”组高（P<0.05），说明这些患者具有较高的复制水平，是具有传染性的重要标志。而且在“大三阳”、“小三阳”2种不同情况中，其血清HBV-DNA载量不同，反映体内HBV复制的活跃程度不同，因而HBV-DNA的含量变化与HBV血清标志物的变化基本相一致[2，3]。 196例“小三阳”中，69例检出HBV-DNA阳性，其阳性率为35.20%，拷贝数为（3.68±1.76）×105 /ml。阳性率虽然小于“大三阳”组，但该组病人仍然具有很高的病毒复制，传染性强，说明HbeAb阳性并不表示患者体内没有病毒复制。30例l，5项阳性的血清中，有13例检出HBV-DNA阳性，阳性率为43.33%，其拷贝数为（1.92±1.21）×104/ml，提示该组病人仍具有很强的病毒复制，传染性强，此情况可能为血清转换期或前c区突变。2例1，2，4，5项阳性的HBV-DNA的阳性检出率为100%，PreS -Ag的阳性率为100%，拷贝数为（1.0±0.54）×10 3/rnl，说明患者虽然出现了HbsAb（+），但体内仍有病毒在复制，HbsAb（+）和HbeAg转阴并不意味着病毒的复制停止或减弱。有学者认为，此现象可能与HBV-DNA前C区发生突变有关，出现“免疫逃避”或不同亚型的HBV重叠感染[4]。也有学者证明，乙型肝炎HbsAb（+）出现后，血清内仍有DNA复制，随着时间的推移，HBV-DNA的检出逐渐下降。定量PCR可检测出病人血液中病毒的拷贝数，从而了解病毒在体内复制的动态情况，判断病情、观察疗效、适时调整治疗方案，还可以决定乙肝治疗的终点，用于乙肝病毒变异株的检测，作为肝炎病毒复制的直接实验室依据，具有判断病毒携带者是否具传染性等优点。
ELISA法检测血清HBV标志物是临床诊断HBV感染的传统手段，它检测的是人体对HBV的免疫反应状态，只能定性，而不能定量判断病毒的载量情况。而荧光定量PCR则可以准确地反应出HBV-DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等，由此可见，PCR定量检测乙肝病毒有更大的优势。综上所述，检测HBV-DNA作为判断乙肝患者是否具有传染性，为乙肝患者合理治疗提供了依据，定量PCR检测HBV-DNA在判断体内HBV是否在复制、复制程度、HBV是否被清除等方面有重要作用，而且为临床观察药物疗效、病情转化等提供了有力的依据。
参考文献：
[1]张蓓，杨晓云，刘蕊，等.荧光定量PCR检测HBV—DNA与乙肝两对半检测结果的相关性讨论[J].河北医学杂志，2006，9：835 —838.
[2]尤平涛，王宁红.乙肝两对半模式与乙肝DNA关系的探讨[J].医学动物防制，2006，9：680-682.
[3]何印蕾.实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J].实用医技杂志，2006，22：3954-3955.
[4]邹享珍.前s1抗原与乙型肝炎病毒血清学标志物同时检测的临床意义[J].临床和实验医学杂志，2007，3：87—87.
[5]郭亚光，楼大勇.乙肝前s1抗原与HBV-DNA、HbeAg（HBeAb）相关性的研究[J].安徽医药，2007，5：444.