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摘要：目的 探讨干细胞培养所需饲养层的制备方法。方法 采用胰蛋白酶消化法，将小鼠胚胎制成细胞悬液接种培养。用丝裂霉素C处理MEF细胞制备饲养层，观察处理后的细胞活力及有无再增殖现象。结果 采用0.0625% 胰蛋白酶消化小鼠胚胎组织获得高活力的MEF细胞，用丝裂霉素C处理前后MEF细胞无明显增值，细胞活力在90%以上。结论：该方法可获得高活力的MEF细胞。丝裂霉素C处理后的MEF细胞种植到明胶包被的6孔板中，在1周内可用于干细胞的培养。
关键词：小鼠胚胎成纤维细胞；饲养层；干细胞
近几年，由体细胞直接重构为诱导性多能干（Induced pluripotent stem，IPS）细胞技术的研究正在兴起。胚胎干细胞（ES）需要培养于滋养层上，这已经是一种常规且稳定的培养方式，而IPS细胞在形态和功能上均类似于胚胎干细胞（ES），培养方式也同于ES细胞。目前常用于制备饲养层的细胞主要是小鼠
胚胎成纤维细胞。本文采用胰蛋白酶消化的方法获取MEF细胞，并对MEF细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。摸索条件建立最佳的饲养层培养体系，为开展IPS细胞研究及干细胞的培养奠定基础。
一、小鼠胚胎成纤维细胞的分離与培养
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
取10只7～8周龄清洁级昆明雄性小鼠，4周龄雌性小鼠20只。将雄雌小鼠按1：2合笼，次日早晨检查有阴栓者记为0.5d，选择孕12.5-14.5 d雌鼠获取胎鼠。
1.1.2 主要试剂及仪器
DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Hyclone 公司），兔抗小鼠Vimentin单抗、山羊抗兔IgG、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）。
隔水式二氧化碳培养箱（上海力康设备有限公司）、倒置显微镜（日本Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 MEF细胞的分离与培养
取孕12.5～14.5 d的昆明系清洁级雌鼠，引颈处死，无菌打开腹腔，取出有胚胎的子宫，在预温的D-hanks液平皿中分离胚胎，去除头、四肢和内脏，用无菌眼科剪将胎鼠剪成1mm3大小碎片，移入盛有4ml 0.0625% 胰蛋白酶离心管中，37℃水浴恒温磁力搅拌消化，消化3次，三次弃上清后，以含1O %胎牛血清的高糖DMEM培养液配制细胞悬液，吹打均匀，调整浓度为4×105个/ ml接种于25 cm2培养瓶中。于37℃ 5%CO2 培养箱中培养；24h后首次换液，之后隔日换液。3～5d传代一次。
1.2.2 培养HFF细胞的鉴定
利用免疫细胞化学染色对MEF细胞进行鉴定。取培养第3代MEF细胞，以兔抗小鼠波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体为一抗，用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合法（SABC法）进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。细胞质中出现棕色颗粒为MEF细胞。
2 结果
2.1 MEF细胞的取材
孕13.5d的小鼠子宫呈串珠样，内有大小约2cm×1cm胚胎10个左右。
2.2 MEF细胞的光镜观察
MEF在体外为贴壁生长型细胞。刚分离的MEF呈圆形，2h左右细胞开始贴壁，培养12h时大部分细胞贴壁，此时可见胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形等。72h后可形成细胞单层，消化传代。
2.3 MEF细胞的免疫细胞化学染色鉴定
实验组用兔抗小鼠波形蛋白单克隆抗体作为一抗，用SABC法对细胞进行免疫化学染色，细胞胞浆呈棕色染色为MEF细胞。
二、饲养层的制备
1 材料与方法
1.1 材料
丝裂霉素C（美国罗氏公司）：取2mg丝裂霉素C在无菌条件下加入2ML Milli-Q水，混匀后分装，-20℃保存。
0.1%明胶溶液（美国Sigma公司）：0.5g明胶溶解于500mlMilli-Q水（50-60℃）冷却至室温0.22um滤器过滤。
1.2 方法
复苏MEF细胞并计数、测细胞活力。弃去培养液，在长满MEF细胞的25cm2培养瓶中加15ug/ml丝裂霉素C培养液1ml，1.5h后吸出培养液，PBS洗6～7遍，用0.25%的胰蛋白酶消化，培养24h后对细胞进行计数和测细胞活力，并观察丝裂霉素C处理后有无再增殖现象。用0.1%的明胶包被六孔板，30min后吸出，在超净台上风干，将丝裂霉素C处理过的MEF细胞悬液种植于6孔板孔内，MEF细胞贴壁生长过夜后即可应用。
2 结果
按上述方法进行丝裂霉素C处理MEF细胞，处理前后MEF细胞无明显增殖，细胞活力在90%以上。处理后的MEF种植到明胶包被的6孔板中，在1周内用于干细胞的培养。
三、讨论
目前，IPS细胞的培养多由小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层。饲养层细胞经过用丝裂霉素C处理后，虽是活细胞但已失去分裂增殖的能力，此时的小鼠胚胎成纤维细胞能分泌促进干细胞增殖和抑制干细胞分化的因子，如LIF等。但因为胚胎成纤维细胞的生命期有限，为了满足干细胞继续培养下去的要求，必需不断制备MEF饲养层，而MEF细胞作为干细胞的饲养层，越传代其分泌LIF的能力越弱，因此我们要用前5代MEF细胞做滋养层。
胎鼠日龄对原代MEF细胞的分离有一定影响，不同学者对分离原代MEF细胞的时间持不同看法：8～20d、11～16d、10～18d龄胎儿时间都可分离到原代MEF细胞[1]，我们从实验中得出10.5～15.5d的胎鼠均获得原代MEF胞，13.5～14.5d被认为是最佳分离时间，采用胰蛋白酶酶消化法能在较短时间内得到大量较纯的MEF细胞。
在用胰蛋白酶酶消化组织细胞时，既要离散细胞，又要防止消化液对细胞的过度损害，由于各实验室的条件不尽相同，胰蛋白酶消化时间也不完全一致。我们采用的是0.0625%的胰蛋白酶分次消化8min，共消化3次，得到足量且高活力的MEF细胞，与刘民等[2]和张怡等[3]的研究结果基本一致。
MEF细胞在经丝裂霉素C处理时，成纤维细胞失去了有丝分裂活性，处理时间短，大部分成纤维细胞会出现继续增殖，时间过久，成纤维细胞死亡之后细胞释放一些DNA碎片和溶酶体酶进入培养液，干扰干细胞的生长。因此我们将由文献报道的2h改为90min，效果良好。也有文献报道采用放射线使MEF细胞失去活性的。
参考文献：
[1] 安立龙，杨奇，冯秀亮，等.牛类胚胎干细胞的分离与克隆[J].中国农业科学.2001，34（5）：550-555.
[2]刘民，李柏青.小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑抑制[J].中国实验动物学杂志，2002，12（4）：215-219.
[3]张怡，赵连三，汪成孝，等.小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养[J].四川大学学报（医学版）.2003，34（2）：344-346.
关键词：小鼠胚胎成纤维细胞；饲养层；干细胞
近几年，由体细胞直接重构为诱导性多能干（Induced pluripotent stem，IPS）细胞技术的研究正在兴起。胚胎干细胞（ES）需要培养于滋养层上，这已经是一种常规且稳定的培养方式，而IPS细胞在形态和功能上均类似于胚胎干细胞（ES），培养方式也同于ES细胞。目前常用于制备饲养层的细胞主要是小鼠
胚胎成纤维细胞。本文采用胰蛋白酶消化的方法获取MEF细胞，并对MEF细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。摸索条件建立最佳的饲养层培养体系，为开展IPS细胞研究及干细胞的培养奠定基础。
一、小鼠胚胎成纤维细胞的分離与培养
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
取10只7～8周龄清洁级昆明雄性小鼠，4周龄雌性小鼠20只。将雄雌小鼠按1：2合笼，次日早晨检查有阴栓者记为0.5d，选择孕12.5-14.5 d雌鼠获取胎鼠。
1.1.2 主要试剂及仪器
DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Hyclone 公司），兔抗小鼠Vimentin单抗、山羊抗兔IgG、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）。
隔水式二氧化碳培养箱（上海力康设备有限公司）、倒置显微镜（日本Olympus）。
1.2 方法
1.2.1 MEF细胞的分离与培养
取孕12.5～14.5 d的昆明系清洁级雌鼠，引颈处死，无菌打开腹腔，取出有胚胎的子宫，在预温的D-hanks液平皿中分离胚胎，去除头、四肢和内脏，用无菌眼科剪将胎鼠剪成1mm3大小碎片，移入盛有4ml 0.0625% 胰蛋白酶离心管中，37℃水浴恒温磁力搅拌消化，消化3次，三次弃上清后，以含1O %胎牛血清的高糖DMEM培养液配制细胞悬液，吹打均匀，调整浓度为4×105个/ ml接种于25 cm2培养瓶中。于37℃ 5%CO2 培养箱中培养；24h后首次换液，之后隔日换液。3～5d传代一次。
1.2.2 培养HFF细胞的鉴定
利用免疫细胞化学染色对MEF细胞进行鉴定。取培养第3代MEF细胞，以兔抗小鼠波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体为一抗，用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合法（SABC法）进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。细胞质中出现棕色颗粒为MEF细胞。
2 结果
2.1 MEF细胞的取材
孕13.5d的小鼠子宫呈串珠样，内有大小约2cm×1cm胚胎10个左右。
2.2 MEF细胞的光镜观察
MEF在体外为贴壁生长型细胞。刚分离的MEF呈圆形，2h左右细胞开始贴壁，培养12h时大部分细胞贴壁，此时可见胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形等。72h后可形成细胞单层，消化传代。
2.3 MEF细胞的免疫细胞化学染色鉴定
实验组用兔抗小鼠波形蛋白单克隆抗体作为一抗，用SABC法对细胞进行免疫化学染色，细胞胞浆呈棕色染色为MEF细胞。
二、饲养层的制备
1 材料与方法
1.1 材料
丝裂霉素C（美国罗氏公司）：取2mg丝裂霉素C在无菌条件下加入2ML Milli-Q水，混匀后分装，-20℃保存。
0.1%明胶溶液（美国Sigma公司）：0.5g明胶溶解于500mlMilli-Q水（50-60℃）冷却至室温0.22um滤器过滤。
1.2 方法
复苏MEF细胞并计数、测细胞活力。弃去培养液，在长满MEF细胞的25cm2培养瓶中加15ug/ml丝裂霉素C培养液1ml，1.5h后吸出培养液，PBS洗6～7遍，用0.25%的胰蛋白酶消化，培养24h后对细胞进行计数和测细胞活力，并观察丝裂霉素C处理后有无再增殖现象。用0.1%的明胶包被六孔板，30min后吸出，在超净台上风干，将丝裂霉素C处理过的MEF细胞悬液种植于6孔板孔内，MEF细胞贴壁生长过夜后即可应用。
2 结果
按上述方法进行丝裂霉素C处理MEF细胞，处理前后MEF细胞无明显增殖，细胞活力在90%以上。处理后的MEF种植到明胶包被的6孔板中，在1周内用于干细胞的培养。
三、讨论
目前，IPS细胞的培养多由小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层。饲养层细胞经过用丝裂霉素C处理后，虽是活细胞但已失去分裂增殖的能力，此时的小鼠胚胎成纤维细胞能分泌促进干细胞增殖和抑制干细胞分化的因子，如LIF等。但因为胚胎成纤维细胞的生命期有限，为了满足干细胞继续培养下去的要求，必需不断制备MEF饲养层，而MEF细胞作为干细胞的饲养层，越传代其分泌LIF的能力越弱，因此我们要用前5代MEF细胞做滋养层。
胎鼠日龄对原代MEF细胞的分离有一定影响，不同学者对分离原代MEF细胞的时间持不同看法：8～20d、11～16d、10～18d龄胎儿时间都可分离到原代MEF细胞[1]，我们从实验中得出10.5～15.5d的胎鼠均获得原代MEF胞，13.5～14.5d被认为是最佳分离时间，采用胰蛋白酶酶消化法能在较短时间内得到大量较纯的MEF细胞。
在用胰蛋白酶酶消化组织细胞时，既要离散细胞，又要防止消化液对细胞的过度损害，由于各实验室的条件不尽相同，胰蛋白酶消化时间也不完全一致。我们采用的是0.0625%的胰蛋白酶分次消化8min，共消化3次，得到足量且高活力的MEF细胞，与刘民等[2]和张怡等[3]的研究结果基本一致。
MEF细胞在经丝裂霉素C处理时，成纤维细胞失去了有丝分裂活性，处理时间短，大部分成纤维细胞会出现继续增殖，时间过久，成纤维细胞死亡之后细胞释放一些DNA碎片和溶酶体酶进入培养液，干扰干细胞的生长。因此我们将由文献报道的2h改为90min，效果良好。也有文献报道采用放射线使MEF细胞失去活性的。
参考文献：
[1] 安立龙，杨奇，冯秀亮，等.牛类胚胎干细胞的分离与克隆[J].中国农业科学.2001，34（5）：550-555.
[2]刘民，李柏青.小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑抑制[J].中国实验动物学杂志，2002，12（4）：215-219.
[3]张怡，赵连三，汪成孝，等.小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养[J].四川大学学报（医学版）.2003，34（2）：344-346.