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自噬是真核生物中常见的自我清除、进化保守的过程，依赖于溶酶体降解途径。当细胞受到刺激后，自噬体会吞噬长寿命蛋白、清除受损害的细胞器和错误折叠的蛋白质，使细胞在应激条件下循环产生能量来存活。这一过程对细胞耐受饥饿、维持胞内稳态至关重要。研究表明，细胞自噬在免疫防御、抑制神经退行性疾病、癌症等方面也发挥了重要作用，因此对与自噬相关蛋白结构的解析会对疾病的治疗提供潜在药物靶标。
自噬是一个高度动态的，多步的过程，它的发生主要经历以下阶段:自噬的诱导;自噬前体的形成;自噬体的成熟;自噬体与溶酶体融合并完成内容物的降解。其中自噬体与溶酶体的融合是自噬的关键过程，需要多种蛋白的参与。已知SNAREs属于膜锚定蛋白，主要作用是介导囊泡与靶膜的融合。STX17属于t-SNAREs，定位于自噬体上，VAMP8属于v-SNAREs，主要定位于溶酶体上。研究证明VAMP8可以与SNAP29和募集在完整自噬体外膜上的STX17相互作用，形成STX17-SNAP29-VAMP8三元复合物从而介导自噬体与溶酶体的膜融合过程。HOPS是一个多蛋白复合体，由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41组成，能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输，功能之一就是调控SNARE复合物的“组装”。研究表明HOPS复合体作为融合因子能够与STX17相互作用，从而促进自噬体与溶酶体膜融合过程。因此本试验拟利用纯化蛋白先在体外确定HOPS复合体与定位在自噬体上的STX17蛋白是否具有直接相互作用，然后探究其是否与SNAP29及定位于溶酶体上的VAMP8蛋白也存在相互作用。
首先利用PCR技术从已有质粒中扩增出六种基因的编码序列，将其连接至pGEX4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上。经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建出pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS18、pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS33、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS39和pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS41六种重组质粒，然后转入E.coliBL21(DE3)，采用IPTG诱导表达重组蛋白，在确定六种重组蛋白均具有可溶性后，利用谷胱甘肽琼脂糖树脂及镍柱两种亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，TEV蛋白酶酶切掉GST、NusA融合标签。结果显示:经考马斯亮蓝快速染色和Westernblot鉴定:在IPTG诱导浓度为0.2mmol/L、诱导温度22℃、诱导时间16h的条件下，重组质粒pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、VPS18、VPS39高效表达，最终分别得到分子量约为105kDa、108kDa和97kDa的带HA标签的重组蛋白;在IPTG诱导浓度为0.2mmol/L、诱导温度28℃、诱导时间5h的条件下，重组质粒pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、VPS33、VPS41高效表达，最终分别得到分子量约为97kDa、70kDa和98kDa的带Flag标签的重组蛋白。最后采用invitroGSTpull-down方法证实STX17、SNAP29和VAMP8与组成HOPS的六种重组蛋白在体外均具有直接相互作用。
综上:本研究成功纯化得到六种组成HOPS复合体的重组蛋白，并在体外验证了其与SNARE蛋白STX17、SNAP29和VAMP8的相互作用，为在体外揭示HOPS复合体在自噬体与溶酶体膜融合过程中的作用机制提供了切实可行的试验途径，并为进一步研究HOPS的生物学功能奠定了基础。
自噬是一个高度动态的，多步的过程，它的发生主要经历以下阶段:自噬的诱导;自噬前体的形成;自噬体的成熟;自噬体与溶酶体融合并完成内容物的降解。其中自噬体与溶酶体的融合是自噬的关键过程，需要多种蛋白的参与。已知SNAREs属于膜锚定蛋白，主要作用是介导囊泡与靶膜的融合。STX17属于t-SNAREs，定位于自噬体上，VAMP8属于v-SNAREs，主要定位于溶酶体上。研究证明VAMP8可以与SNAP29和募集在完整自噬体外膜上的STX17相互作用，形成STX17-SNAP29-VAMP8三元复合物从而介导自噬体与溶酶体的膜融合过程。HOPS是一个多蛋白复合体，由VPS11、VPS16、VPS18、VPS33、VPS39和VPS41组成，能够通过膜融合机制来调节生物体内的膜泡运输，功能之一就是调控SNARE复合物的“组装”。研究表明HOPS复合体作为融合因子能够与STX17相互作用，从而促进自噬体与溶酶体膜融合过程。因此本试验拟利用纯化蛋白先在体外确定HOPS复合体与定位在自噬体上的STX17蛋白是否具有直接相互作用，然后探究其是否与SNAP29及定位于溶酶体上的VAMP8蛋白也存在相互作用。
首先利用PCR技术从已有质粒中扩增出六种基因的编码序列，将其连接至pGEX4T-1-GST或pET-His-NusA原核表达载体上。经菌落PCR初步鉴定和DNA测序无误后成功构建出pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS18、pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS33、pET-His-NusA-TEV-HA-VPS39和pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS41六种重组质粒，然后转入E.coliBL21(DE3)，采用IPTG诱导表达重组蛋白，在确定六种重组蛋白均具有可溶性后，利用谷胱甘肽琼脂糖树脂及镍柱两种亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，TEV蛋白酶酶切掉GST、NusA融合标签。结果显示:经考马斯亮蓝快速染色和Westernblot鉴定:在IPTG诱导浓度为0.2mmol/L、诱导温度22℃、诱导时间16h的条件下，重组质粒pET-His-NusA-TEV-HA-VPS11、VPS18、VPS39高效表达，最终分别得到分子量约为105kDa、108kDa和97kDa的带HA标签的重组蛋白;在IPTG诱导浓度为0.2mmol/L、诱导温度28℃、诱导时间5h的条件下，重组质粒pGEX4T-1-GST-TEV-Flag-VPS16、VPS33、VPS41高效表达，最终分别得到分子量约为97kDa、70kDa和98kDa的带Flag标签的重组蛋白。最后采用invitroGSTpull-down方法证实STX17、SNAP29和VAMP8与组成HOPS的六种重组蛋白在体外均具有直接相互作用。
综上:本研究成功纯化得到六种组成HOPS复合体的重组蛋白，并在体外验证了其与SNARE蛋白STX17、SNAP29和VAMP8的相互作用，为在体外揭示HOPS复合体在自噬体与溶酶体膜融合过程中的作用机制提供了切实可行的试验途径，并为进一步研究HOPS的生物学功能奠定了基础。