论文部分内容阅读
金针菇(Flammulina velutipes)是目前国内消费量最大的食用菌之一，2017年我国金针菇产量超过300万吨，占国内食用菌总量的10％左右。金针菇不仅营养丰富，而且含有多糖、蛋白质和倍半萜等生物活性成分，具有维持肠道健康、抗氧化等多种功能作用。本课题组前期对金针菇多糖保护神经、提高学习及记忆能力方面进行了研究，证明金针菇多糖具备改善学习记忆能力，但是金针菇多糖改善记忆具体作用机制尚不完善。近年来研究显示肠道与大脑具有双向交流机制，肠道菌群可能是学习记忆能力改变的影响因素。基于此，本研究从肠道菌群角度出发，研究金针菇多糖与肠道菌群的相互作用，挖掘其对肠道菌群结构的调节规律，解析肠道菌群变化对肠道、脑部组织、神经传导的影响，从肠道菌群角度阐明金针菇多糖改善记忆作用机制。具体研究结果如下:
1、以冻干金针菇为原料，制备金针菇多糖(FVP)，通过体外模拟口腔唾液、胃液、小肠胰液以及粪菌发酵条件，研究金针菇多糖的消化降解过程。制备的金针菇多糖纯度为92.39±2.24％，主要有葡萄糖、甘露糖、木糖、岩藻糖和半乳糖五种单糖组成，其摩尔比分别为48.4∶15.4∶14.6∶11.8∶9.9。制备的金针菇多糖是吡喃型葡萄糖为主链的杂多糖。金针菇多糖在唾液、模拟胃液、胰液消化过程中分子量、游离单糖、还原糖均没有发生明显变化，表明在唾液、模拟胃液、胰液消化阶段金针菇多糖没有发生降解，唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶均不能与金针菇多糖发生反应。而在粪菌发酵过程中，分子量逐渐变小，并且有小分子量的物质出现，还原糖和总糖的含量显著降低(p＜0.05)，表明金针菇多糖可以被肠道菌群降解利用。由此可知，金针菇多糖可以通过口腔、胃及小肠阶段，而到达肠道菌群所在的结肠区域并被降解利用，为调节肠道菌群结构提供了可能。
2、采用体外厌氧发酵模型研究发现，金针菇多糖可以调节菌群结构。具体表现在:在门水平，金针菇多糖的添加增加了Bacteroidetes和Actinobacteria的丰度，降低了Firmicutes和Proteobacteria的丰度(p＜0.05)。在科水平金针菇多糖的添加能够显著提高Bifidobacteriaceae和Bacteroidaceae的丰度(p＜0.05)，降低Enterobacteriaceae(p＜0.05)的丰度。在属水平金针菇多糖的添加显著提高Bifidobacterium、Bacteroides和Clostridium的丰度(p＜0.05)，降低EscherichiaShigella的丰度。此外，金针菇多糖与肠道菌群相互作用，促进乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等短链脂肪酸的生成，降低发酵体系的pH值，同时，金针菇多糖提高了酪氨酸、N-乙酰天冬氨酸、鞘氨醇等代谢产物的含量。通过分析金针菇多糖影响的肠道菌群、代谢产物的生物学功能，发现这些改变与神经递质的产生、信号传导等神经系统健康，特别是神经退行性疾病密切相关。由此推断，金针菇多糖调节的肠道菌群结构和代谢变化可能是其改善记忆的原因之一。
3、通过动物试验进一步研究了金针菇多糖对肠道菌群的影响。结果显示，小鼠肠道菌群优势菌主要是Bacteroidia、Clostridia、Erysipelotrichia、Bacilli、和Actinobacteria等。金针菇多糖的摄入可以增加Bacteroidia、Erysipelotrichia、Actinobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria的丰度(p＜0.05)，降低Clostridia、Bacilli、Deltaproteobacteria、Verrucomicrobiae的丰度(p＜0.05)。通过粪菌移植技术研究，发现金针菇多糖所调节的肠道菌群可以改善东莨菪碱诱导的记忆损伤，其作用效果和直接灌胃金针菇多糖相当(p＞0.05)，同时可以提高海马中乙酰胆碱(ACh)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)等神经递质的生成，增强丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性，提高总抗氧化能力(T-AOC);抑制血清中IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的升高。由此可以初步确认，金针菇多糖调节肠道菌群结构和代谢变化与改善记忆具有因果关系。
4、通过肠道不吸收的抗生素清除小鼠肠道菌群，制备肠道菌群紊乱模型，系统研究了肠道菌群对学习记忆的影响及作用机制，同时通过灌胃金针菇多糖和自然恢复，进一步确认了金针菇多糖通过调节肠道菌群的改善记忆作用。结果显示，抗生素处理降低了肠道菌群的丰富度和多样性，造成肠道菌群紊乱。肠道菌群紊乱可导致学习记忆功能障碍，降低肠上皮之间的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达，破坏肠黏膜物理屏障，导致肠道通透性增加;同时，通过影响编码5-羟色胺转运体基因SLC6A4以及神经肽Y的受体NPY1R和NPY2R的表达干扰5-羟色胺、神经肽等神经递质的分泌;此外，肠道菌群的缺失降低脑部紧密连接蛋白TJP1和CLDN5的合成，增大血脑屏障的通透性，减少脑源性神经营养因子BDNF生成。这些影响在停止抗生素处理后14天仍未完全恢复，而通过摄入金针菇多糖可以使肠道菌群和记忆恢复正常。
1、以冻干金针菇为原料，制备金针菇多糖(FVP)，通过体外模拟口腔唾液、胃液、小肠胰液以及粪菌发酵条件，研究金针菇多糖的消化降解过程。制备的金针菇多糖纯度为92.39±2.24％，主要有葡萄糖、甘露糖、木糖、岩藻糖和半乳糖五种单糖组成，其摩尔比分别为48.4∶15.4∶14.6∶11.8∶9.9。制备的金针菇多糖是吡喃型葡萄糖为主链的杂多糖。金针菇多糖在唾液、模拟胃液、胰液消化过程中分子量、游离单糖、还原糖均没有发生明显变化，表明在唾液、模拟胃液、胰液消化阶段金针菇多糖没有发生降解，唾液淀粉酶、胃蛋白酶、胰酶均不能与金针菇多糖发生反应。而在粪菌发酵过程中，分子量逐渐变小，并且有小分子量的物质出现，还原糖和总糖的含量显著降低(p＜0.05)，表明金针菇多糖可以被肠道菌群降解利用。由此可知，金针菇多糖可以通过口腔、胃及小肠阶段，而到达肠道菌群所在的结肠区域并被降解利用，为调节肠道菌群结构提供了可能。
2、采用体外厌氧发酵模型研究发现，金针菇多糖可以调节菌群结构。具体表现在:在门水平，金针菇多糖的添加增加了Bacteroidetes和Actinobacteria的丰度，降低了Firmicutes和Proteobacteria的丰度(p＜0.05)。在科水平金针菇多糖的添加能够显著提高Bifidobacteriaceae和Bacteroidaceae的丰度(p＜0.05)，降低Enterobacteriaceae(p＜0.05)的丰度。在属水平金针菇多糖的添加显著提高Bifidobacterium、Bacteroides和Clostridium的丰度(p＜0.05)，降低EscherichiaShigella的丰度。此外，金针菇多糖与肠道菌群相互作用，促进乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等短链脂肪酸的生成，降低发酵体系的pH值，同时，金针菇多糖提高了酪氨酸、N-乙酰天冬氨酸、鞘氨醇等代谢产物的含量。通过分析金针菇多糖影响的肠道菌群、代谢产物的生物学功能，发现这些改变与神经递质的产生、信号传导等神经系统健康，特别是神经退行性疾病密切相关。由此推断，金针菇多糖调节的肠道菌群结构和代谢变化可能是其改善记忆的原因之一。
3、通过动物试验进一步研究了金针菇多糖对肠道菌群的影响。结果显示，小鼠肠道菌群优势菌主要是Bacteroidia、Clostridia、Erysipelotrichia、Bacilli、和Actinobacteria等。金针菇多糖的摄入可以增加Bacteroidia、Erysipelotrichia、Actinobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria的丰度(p＜0.05)，降低Clostridia、Bacilli、Deltaproteobacteria、Verrucomicrobiae的丰度(p＜0.05)。通过粪菌移植技术研究，发现金针菇多糖所调节的肠道菌群可以改善东莨菪碱诱导的记忆损伤，其作用效果和直接灌胃金针菇多糖相当(p＞0.05)，同时可以提高海马中乙酰胆碱(ACh)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)等神经递质的生成，增强丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性，提高总抗氧化能力(T-AOC);抑制血清中IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的升高。由此可以初步确认，金针菇多糖调节肠道菌群结构和代谢变化与改善记忆具有因果关系。
4、通过肠道不吸收的抗生素清除小鼠肠道菌群，制备肠道菌群紊乱模型，系统研究了肠道菌群对学习记忆的影响及作用机制，同时通过灌胃金针菇多糖和自然恢复，进一步确认了金针菇多糖通过调节肠道菌群的改善记忆作用。结果显示，抗生素处理降低了肠道菌群的丰富度和多样性，造成肠道菌群紊乱。肠道菌群紊乱可导致学习记忆功能障碍，降低肠上皮之间的紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达，破坏肠黏膜物理屏障，导致肠道通透性增加;同时，通过影响编码5-羟色胺转运体基因SLC6A4以及神经肽Y的受体NPY1R和NPY2R的表达干扰5-羟色胺、神经肽等神经递质的分泌;此外，肠道菌群的缺失降低脑部紧密连接蛋白TJP1和CLDN5的合成，增大血脑屏障的通透性，减少脑源性神经营养因子BDNF生成。这些影响在停止抗生素处理后14天仍未完全恢复，而通过摄入金针菇多糖可以使肠道菌群和记忆恢复正常。