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T-2毒素是由镰刀菌菌属的拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)和梨孢镰刀菌(F.poae)等在特定条件下产生的一种单端孢霉烯族化合物。T-2毒素广泛存在于自然界，长期摄入被T-2毒素污染的谷物和饲料后会损害动物和人体健康，可使畜禽等动物出现厌食、生长发育不良、生产性能下降等特征，并可引起人类骨髓和血液毒性等。但目前T-2毒素对动物急性损伤的主要毒性特征、靶器官以及T-2毒素发挥毒性作用的分子机制尚不清楚。因此，在国家重点研发计划生物安全关键技术研发重点专项(2017YFC1200901)的资助下，本文从以下三个方面开展本研究，一是构建T-2毒素对动物损伤的急性毒性评价模型，二是构建T-2毒素对肾脏损伤的细胞评价模型，三是构建T-2毒素引起免疫毒性的细胞评价模型。具体研究内容及结果如下:
1.按照经济合作与发展组织推荐的急性经口毒性:上下增减剂量法(UDP)选择7～8周龄雌性Wistar大鼠构建T-2毒素对动物损伤的急性毒性评价模型。按照UDP法的要求，设T-2毒素染毒剂量依次为17.5、5.5和1.75mg/kg·bw，结果表明T-2毒素对雌性Wistar大鼠的半数致死剂量LD50为2.957mg/kg·bw，95％置信区间为1.75～5.5mg/kg·bw。试验共使用8只大鼠，除对照组大鼠外，所有大鼠均在染毒3h左右出现中毒体征，毒性特征表现为不再进食和饮水、毛竖立、闭目静卧。17.5mg/kg·bw剂量组大鼠有尿血、粪便不成形症状出现，染毒后11h死亡;5.5mg/kg·bw剂量组大鼠表现为四肢无力、步态蹒跚，最后下肢瘫痪，染毒后30h死亡，死亡时口、鼻、尾呈现青紫色;1.75mg/kg·bw剂量组大鼠染毒24h后毒性症状减轻并好转，可正常进食和饮水;所有染毒大鼠体重均有不同程度的下降。组织病理学检查显示T-2毒素对染毒大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胸腺、卵巢和子宫均有不同程度的损伤，其中肾脏、脾脏和胸腺为T-2毒素急性毒性的主要靶器官。
2.基于T-2毒素急性毒性评价模型，以人肾小管上皮细胞HK-2为研究对象，构建T-2毒素对肾脏损伤的细胞评价模型。将体外培养的HK-2细胞，经不同浓度的T-2毒素作用72h后，采用CCK-8、Hoechst33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪和分光光度法分别测定T-2毒素对HK-2细胞增殖抑制率、细胞凋亡形态、DNA片段化、细胞凋亡率、细胞周期分布、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)和caspase-3活性的影响。结果表明T-2毒素对HK-2细胞具有增殖毒性，在20～250nmol/L范围内可以明显抑制HK-2细胞的增殖，抑制率随浓度升高而增大，半数抑制浓度IC50为49.34nmol/L;Hoechst荧光染色显示20nmol/LT-2毒素作用后HK-2细胞出现染色质固缩等凋亡细胞的典型形态。流式细胞仪检测发现T-2毒素在10～40nmol/L范围内可剂量依赖性的诱导HK-2细胞早期凋亡，引起G2/M期阻滞影响HK-2细胞的周期分布;同时T-2毒素可引起HK-2细胞caspase-3活性增强，与对照组相比，40nmol/LT-2毒素作用后caspase-3活性提高到1.93倍(P＜0.05);可诱导ROS生成增加，与对照组相比，20和30nmol/LT-2毒素刺激后HK-2细胞的ROS含量明显升高(P＜0.05);可导致线粒体膜电位降低，与对照组相比，40nmol/LT-2毒素可导致HK-2细胞MMP明显下降(P＜0.05)。综上，T-2毒素可能通过线粒体途径激活caspase-3诱导HK-2细胞凋亡。
3.基于T-2毒素急性毒性评价模型，以人组织细胞淋巴瘤细胞U937为研究对象，构建T-2毒素引起免疫毒性的细胞评价模型。将体外培养的U937细胞，经不同浓度的T-2毒素作用72h后，采用CCK-8、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪和分光光度法分别测定T-2毒素对U937细胞增殖抑制率、DNA片段化、细胞凋亡率、细胞周期分布、ROS、MMP和caspase-3活性的影响。结果表明T-2毒素对U937细胞具有增殖毒性，在2.0～20nmol/L范围内可以明显抑制U937细胞的增殖，抑制率随浓度升高而增大;IC50为4.31nmol/L。流式细胞仪检测发现T-2毒素在1～4nmol/L范围内几乎不引起细胞发生凋亡，但8.0nmol/LT-2毒素作用后凋亡细胞的比例明显上升，总凋亡细胞比例可达75.04％(P＜0.05);T-2毒素在4～8nmol/L范围内，可引起G0/G1期阻滞影响U937细胞的周期分布。同时，T-2毒素可引起U937细胞caspase-3活性增强，与对照组相比，4nmol/LT-2毒素作用后caspase-3活性提高到2.57倍(P＜0.05)，8nmol/LT-2毒素作用U937细胞后由于细胞多数已发生晚期凋亡，因此几乎检测不到caspase-3活性;对U937细胞内ROS的生成有影响，与对照组相比，在1～4nmol/L范围内，T-2毒素作用U937细胞后ROS含量升高不显著，而8.0nmol/LROS含量明显降低(P＜0.05);可导致MMP降低，与对照组相比，8nmol/LT-2毒素作用后可导致U937细胞MMP明显下降(P＜0.05)。综上，T-2毒素可能通过线粒体途径激活caspase-3诱导U937细胞凋亡。
1.按照经济合作与发展组织推荐的急性经口毒性:上下增减剂量法(UDP)选择7～8周龄雌性Wistar大鼠构建T-2毒素对动物损伤的急性毒性评价模型。按照UDP法的要求，设T-2毒素染毒剂量依次为17.5、5.5和1.75mg/kg·bw，结果表明T-2毒素对雌性Wistar大鼠的半数致死剂量LD50为2.957mg/kg·bw，95％置信区间为1.75～5.5mg/kg·bw。试验共使用8只大鼠，除对照组大鼠外，所有大鼠均在染毒3h左右出现中毒体征，毒性特征表现为不再进食和饮水、毛竖立、闭目静卧。17.5mg/kg·bw剂量组大鼠有尿血、粪便不成形症状出现，染毒后11h死亡;5.5mg/kg·bw剂量组大鼠表现为四肢无力、步态蹒跚，最后下肢瘫痪，染毒后30h死亡，死亡时口、鼻、尾呈现青紫色;1.75mg/kg·bw剂量组大鼠染毒24h后毒性症状减轻并好转，可正常进食和饮水;所有染毒大鼠体重均有不同程度的下降。组织病理学检查显示T-2毒素对染毒大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、胸腺、卵巢和子宫均有不同程度的损伤，其中肾脏、脾脏和胸腺为T-2毒素急性毒性的主要靶器官。
2.基于T-2毒素急性毒性评价模型，以人肾小管上皮细胞HK-2为研究对象，构建T-2毒素对肾脏损伤的细胞评价模型。将体外培养的HK-2细胞，经不同浓度的T-2毒素作用72h后，采用CCK-8、Hoechst33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪和分光光度法分别测定T-2毒素对HK-2细胞增殖抑制率、细胞凋亡形态、DNA片段化、细胞凋亡率、细胞周期分布、活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)和caspase-3活性的影响。结果表明T-2毒素对HK-2细胞具有增殖毒性，在20～250nmol/L范围内可以明显抑制HK-2细胞的增殖，抑制率随浓度升高而增大，半数抑制浓度IC50为49.34nmol/L;Hoechst荧光染色显示20nmol/LT-2毒素作用后HK-2细胞出现染色质固缩等凋亡细胞的典型形态。流式细胞仪检测发现T-2毒素在10～40nmol/L范围内可剂量依赖性的诱导HK-2细胞早期凋亡，引起G2/M期阻滞影响HK-2细胞的周期分布;同时T-2毒素可引起HK-2细胞caspase-3活性增强，与对照组相比，40nmol/LT-2毒素作用后caspase-3活性提高到1.93倍(P＜0.05);可诱导ROS生成增加，与对照组相比，20和30nmol/LT-2毒素刺激后HK-2细胞的ROS含量明显升高(P＜0.05);可导致线粒体膜电位降低，与对照组相比，40nmol/LT-2毒素可导致HK-2细胞MMP明显下降(P＜0.05)。综上，T-2毒素可能通过线粒体途径激活caspase-3诱导HK-2细胞凋亡。
3.基于T-2毒素急性毒性评价模型，以人组织细胞淋巴瘤细胞U937为研究对象，构建T-2毒素引起免疫毒性的细胞评价模型。将体外培养的U937细胞，经不同浓度的T-2毒素作用72h后，采用CCK-8、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪和分光光度法分别测定T-2毒素对U937细胞增殖抑制率、DNA片段化、细胞凋亡率、细胞周期分布、ROS、MMP和caspase-3活性的影响。结果表明T-2毒素对U937细胞具有增殖毒性，在2.0～20nmol/L范围内可以明显抑制U937细胞的增殖，抑制率随浓度升高而增大;IC50为4.31nmol/L。流式细胞仪检测发现T-2毒素在1～4nmol/L范围内几乎不引起细胞发生凋亡，但8.0nmol/LT-2毒素作用后凋亡细胞的比例明显上升，总凋亡细胞比例可达75.04％(P＜0.05);T-2毒素在4～8nmol/L范围内，可引起G0/G1期阻滞影响U937细胞的周期分布。同时，T-2毒素可引起U937细胞caspase-3活性增强，与对照组相比，4nmol/LT-2毒素作用后caspase-3活性提高到2.57倍(P＜0.05)，8nmol/LT-2毒素作用U937细胞后由于细胞多数已发生晚期凋亡，因此几乎检测不到caspase-3活性;对U937细胞内ROS的生成有影响，与对照组相比，在1～4nmol/L范围内，T-2毒素作用U937细胞后ROS含量升高不显著，而8.0nmol/LROS含量明显降低(P＜0.05);可导致MMP降低，与对照组相比，8nmol/LT-2毒素作用后可导致U937细胞MMP明显下降(P＜0.05)。综上，T-2毒素可能通过线粒体途径激活caspase-3诱导U937细胞凋亡。