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阿魏酸酯酶(feruloylesterase，FAE;编号EC3.1.1.73)，可水解阿魏酸酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯之间的酯键并释放阿魏酸。阿魏酸(ferulic acid)，属于一种酚酸类物质，具有抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、抗动脉粥样硬化等良好的生理功能，可广泛应用于医药和化妆品等行业。传统的阿魏酸酯酶筛选是以可溶性的羟基肉桂酸酯类化合物为底物或者以富含阿魏酸的农业原料为酶诱导剂，从可培养微生物中筛选产阿魏酸酯酶的活性菌株并从发酵产物中纯化得到阿魏酸酯酶。然而，这种筛选方式存在操作复杂、耗时长、重复筛选、活性低等问题，极大影响了阿魏酸酯酶在工业中的应用。研究表明土壤中高达99％的微生物是无法通过传统可培养方式得到的，这提示土壤中尚有巨大的不可培养微生物资源还未得到研究和开发。随着分子生物学和高通量测序技术的快速发展，出现了不可培养微生物的研究技术-宏基因组学技术，该技术直接以环境样本中的总DNA为研究对象，选择合适的宿主对DNA进行表达，获得目的产物。该技术可绕开传统分离培养的环节，成为从不可培养微生物中挖掘新型基因、酶、活性天然产物的有效工具。
本研究通过构建宏基因文库，利用功能筛选法获得阿魏酸酯酶基因，进行异源表达，对酶学性质进行表征等研究，具体研究结果如下:
(1)土壤宏基因组文库的构建。采集土壤样本，去除杂质后利用CTAB抽提法提取土壤总DNA，总DNA经过凝胶电泳、透析袋电洗脱、浓缩等方式获得高纯度的DNA，DNA经末端修复、再回收、连入pCC1FOS载体、噬菌体包装后侵染宿主大肠杆菌EPI300、效价测定，计数得到容量约为120000个克隆子的宏基因文库，以5000个克隆子为一个亚库，分装成24个亚库进行保存。
(2)阿魏酸酯酶基因的筛选。以阿魏酸甲酯为底物，利用功能筛选法从构建的宏基因文库中初筛具有活性的单克隆，经HPLC复筛后得到一个活性较强的阿魏酸酯酶单克隆。通过亚克隆法、测序及ORFFinder分析，确定编码阿魏酸酯酶基因序列，并命名为bds4。该序列长951个碱基，编码317个氨基酸，与已知的羧酸酯酶最高相似度仅为35％，提示bds4为新型FAE基因。多序列比对分析结果表明bds4序列上具有保守五肽基序G-X-S-X-G与催化三联体中心Ser158-Asp256-His286。系统发育树显示BDS4与C型阿魏酸酯酶聚为一支，表明BDS4属于C型阿魏酸酯酶。
(3)阿魏酸酯酶基因的异源表达。以bds4基因序列为研究对象，通过PCR扩增、酶切酶连至pET28a表达载体中构建重组质粒pET28a-bds4，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。利用IPTG诱导阿魏酸酯酶的表达，表达产物经超声破碎、离心获得粗酶提取物。采用镍柱耦合亲和层析柱对粗酶进行分离纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定其分子量为39kDa。
(4)阿魏酸酯酶的酶学性质表征。酶学性质研究表明BDS4最适温度为37℃、最适pH为8.0且在pH7.0～8.5的范围内具有较好的稳定性，是一种弱碱性的阿魏酸酯酶。底物特异性实验表明BDS4对阿魏酸乙酯、阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、对香豆素甲酯、香草酸甲酯、芥子酸甲酯均具有水解作用，其中，对阿魏酸甲酯水解能力最强(57.05 U/mg)。添加金属离子及化学试剂实验表明BDS4除了Cu2+、Zn2+、β-巯基乙醇、SDS敏感外，对其他的金属离子类型、有机溶剂、表面活性剂均有良好的耐受性。BDS4在木聚糖酶的存在下可明显提高从麦麸中释放阿魏酸的含量，与BDS4单独水解相比，释放出的阿魏酸提高了4.3倍，说明BDS4与木聚糖酶能够协同促进阿魏酸酯类物质的水解。另外，BDS4对邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二丁酯具有一定的降解作用，表明BDS4在降解塑化剂方面具有潜在的应用价值。
(5)阿魏酸酯酶突变文库的构建与筛选。利用易错PCR技术突变阿魏酸酯酶基因bds4，构建随机突变文库。以酶活性为筛选指标，采用底物平板法初筛与HPLC复筛相结合的方式，筛选到两个活性分别提高了15％和8％的突变体(EP-BDS4-1，EP-BDS4-2)。序列比对分析表明突变体EP-BDS4-1的147位精氨酸与175位谷酰胺被突变;EP-BDS4-2的221位酪氨酸被突变，推测这些氨基酸残基对酶活性的提高有重要影响。
本研究中的BDS4在pH8.0、37℃环境下具有最高活性，能够耐受绝大部分的金属离子、有机试剂和表面活性剂，对阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、对香豆素甲酯、芥子酸甲酯均具有降解能力，并且发现BDS4具有降解邻苯二甲酸酯类塑化剂的能力，而通过随机突变能够提高酶的活性，具有实现工业化的潜力。这些特性使BDS4在生物质和塑化剂降解方面具有潜在的应用价值。该研究结果充分说明宏基因组学技术是挖掘和发现新型酯酶的一种强有力工具。
本研究通过构建宏基因文库，利用功能筛选法获得阿魏酸酯酶基因，进行异源表达，对酶学性质进行表征等研究，具体研究结果如下:
(1)土壤宏基因组文库的构建。采集土壤样本，去除杂质后利用CTAB抽提法提取土壤总DNA，总DNA经过凝胶电泳、透析袋电洗脱、浓缩等方式获得高纯度的DNA，DNA经末端修复、再回收、连入pCC1FOS载体、噬菌体包装后侵染宿主大肠杆菌EPI300、效价测定，计数得到容量约为120000个克隆子的宏基因文库，以5000个克隆子为一个亚库，分装成24个亚库进行保存。
(2)阿魏酸酯酶基因的筛选。以阿魏酸甲酯为底物，利用功能筛选法从构建的宏基因文库中初筛具有活性的单克隆，经HPLC复筛后得到一个活性较强的阿魏酸酯酶单克隆。通过亚克隆法、测序及ORFFinder分析，确定编码阿魏酸酯酶基因序列，并命名为bds4。该序列长951个碱基，编码317个氨基酸，与已知的羧酸酯酶最高相似度仅为35％，提示bds4为新型FAE基因。多序列比对分析结果表明bds4序列上具有保守五肽基序G-X-S-X-G与催化三联体中心Ser158-Asp256-His286。系统发育树显示BDS4与C型阿魏酸酯酶聚为一支，表明BDS4属于C型阿魏酸酯酶。
(3)阿魏酸酯酶基因的异源表达。以bds4基因序列为研究对象，通过PCR扩增、酶切酶连至pET28a表达载体中构建重组质粒pET28a-bds4，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。利用IPTG诱导阿魏酸酯酶的表达，表达产物经超声破碎、离心获得粗酶提取物。采用镍柱耦合亲和层析柱对粗酶进行分离纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定其分子量为39kDa。
(4)阿魏酸酯酶的酶学性质表征。酶学性质研究表明BDS4最适温度为37℃、最适pH为8.0且在pH7.0～8.5的范围内具有较好的稳定性，是一种弱碱性的阿魏酸酯酶。底物特异性实验表明BDS4对阿魏酸乙酯、阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、对香豆素甲酯、香草酸甲酯、芥子酸甲酯均具有水解作用，其中，对阿魏酸甲酯水解能力最强(57.05 U/mg)。添加金属离子及化学试剂实验表明BDS4除了Cu2+、Zn2+、β-巯基乙醇、SDS敏感外，对其他的金属离子类型、有机溶剂、表面活性剂均有良好的耐受性。BDS4在木聚糖酶的存在下可明显提高从麦麸中释放阿魏酸的含量，与BDS4单独水解相比，释放出的阿魏酸提高了4.3倍，说明BDS4与木聚糖酶能够协同促进阿魏酸酯类物质的水解。另外，BDS4对邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二乙酯和邻苯二甲酸二丁酯具有一定的降解作用，表明BDS4在降解塑化剂方面具有潜在的应用价值。
(5)阿魏酸酯酶突变文库的构建与筛选。利用易错PCR技术突变阿魏酸酯酶基因bds4，构建随机突变文库。以酶活性为筛选指标，采用底物平板法初筛与HPLC复筛相结合的方式，筛选到两个活性分别提高了15％和8％的突变体(EP-BDS4-1，EP-BDS4-2)。序列比对分析表明突变体EP-BDS4-1的147位精氨酸与175位谷酰胺被突变;EP-BDS4-2的221位酪氨酸被突变，推测这些氨基酸残基对酶活性的提高有重要影响。
本研究中的BDS4在pH8.0、37℃环境下具有最高活性，能够耐受绝大部分的金属离子、有机试剂和表面活性剂，对阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯、对香豆素甲酯、芥子酸甲酯均具有降解能力，并且发现BDS4具有降解邻苯二甲酸酯类塑化剂的能力，而通过随机突变能够提高酶的活性，具有实现工业化的潜力。这些特性使BDS4在生物质和塑化剂降解方面具有潜在的应用价值。该研究结果充分说明宏基因组学技术是挖掘和发现新型酯酶的一种强有力工具。