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目的
1明确二甲双胍(metformin, MET)协同第三代头孢菌素对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)抗菌增效的作用；
2探索MET抗菌增效作用与抑制细菌外排泵基因表达、群体感应基因表达、群体感应信号分子表达及细菌通透性的相关性。
方法
1细菌培养
采用三区平板划线法培养PA，挑取单克隆菌落接种于LB(Luria-Bertani broth)液体培养基中，作为种子培养液。分别吸取一定量种子培养液接种于不同葡萄糖浓度的MH(Mueller-Hinton broth)、PTSB(peptone trypticase soy broth)培养基，置35℃恒温摇床，150rpm培养，检测各组药物对PA的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)、生长曲线、毒力因子表达、外排泵基因表达、群体感应基因及信号分子表达、胞外多糖含量、磷含量的影响。
2实验分组
测定药物对PA的MIC：设空白对照组、第三代头孢菌素组【头孢他啶(ceftazidime, CAZ)、头孢哌酮(cefoperazone, CFP)、头孢曲松(cefatriaxone, CTR)各12个浓度，分别为128μg·mL-1倍比稀释至0.0625μg·mL-1】、MET组(512μg·mL-1倍比稀释至0.25μg·mL-1共12个药物浓度)、第三代头孢菌素(CAZ、CFP、CTR浓度分别为1/4、1/2、1倍MIC)合用MET(512μg·mL-1倍比稀释至0.25μg·mL-1共12个药物浓度)组，考察药物在不同糖浓度(0、2、5、12.5、31.25 mmol·L-1)时对PA的MIC。
测定药物对PA生长曲线的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ浓度分别为32μg·mL-1倍比稀释至0.0156μg·mL-1，CFP、CTR浓度分别为128μg·mL-1倍比稀释至0.0625μg·mL-1)、MET组(512μg·mL-1倍比稀释至0.25μg·mL-1)、第三代头孢菌素(CAZ、CFP、CTR浓度分别为1/8、1/4、1/2、1倍MIC)合用MET(0.25、1、4μg·mL-1)组，考察药物在不同糖浓度(0、2、5、12.5、31.25 mmol·L-1)时对PA生长曲线的作用。
测定药物对PA毒力因子表达的作用：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ、CFP、CTR浓度分别为1/2、2倍MIC)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA毒力因子的作用。
测定药物对PA外排泵及群体感应相关基因表达的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ、CFP、CTR浓度为1/4倍MIC)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA外排泵及群体感应相关基因表达的作用。
测定药物对PA群体感应信号分子的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ0.25μg·mL-1、CFP1μg·mL-1、CTR4μg·mL-1)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA群体感应信号分子表达的作用。
测定药物对PA胞外多糖的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ浓度为0.25μg·mL-1、CFP浓度为1μg·mL-1、CTR浓度为4μg·mL-1)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA胞外多糖含量的作用。
测定药物对PA磷含量的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ浓度为0.25μg·mL-1、CFP浓度为1μg·mL-1、CTR浓度为4μg·mL-1)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA磷含量的作用。
3测定指标
3.1微量稀释法测定药物对PA的MIC；
3.2比浊法测定PA生长曲线；
3.3光密度法测定绿脓菌素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶表达；
3.4Real-timePCR测定MexA、MexX、MexD、lasR、rhlR基因表达；
3.5细菌生物感应器测定群体感应信号分子表达；
3.6苯酚硫酸法测定胞外多糖含量；
3.7磷钼蓝比色法测定磷含量。
结果
1CAZ对PA的MIC为1μg·mL-1，CFP对PA的MIC为4μg·mL-1，CTR对PA的MIC为16μg·mL-1；实验浓度下，MET无抑制PA的作用且不改变第三代头孢菌素对PA的MIC；药物对PA的MIC不受葡萄糖浓度的影响。
2葡萄糖浓度依赖性促进PA生长。MET浓度依赖地协同第三代头孢菌素抑制PA生长。
3葡萄糖浓度依赖性促进PA毒力因子表达，MET浓度依赖地协同第三代头孢菌素抑制PA毒力因子表达。
4葡萄糖浓度依赖性促进PA外排泵基因(MexA)、群体感应基因(lasR、rhlR)的表达；MET浓度依赖地抑制MexA、lasR、rhlR表达，并协同第三代头孢菌素抑制lasR、rhlR表达。
5MET协同第三代头孢菌素抑制PA群体感应信号分子、胞外多糖及磷含量。
结论
1在高糖状态下，MET(0.25、1、4μg·mL-1)协同第三代头孢菌素具有浓度依赖性抑制PA生长的作用。
2MET(1、4μg·mL-1)浓度依赖性协同第三代头孢菌素抑制PA随葡萄糖浓度正相关增加的毒力因子(包括PA绿脓菌素、PA蛋白水解酶、PA弹性蛋白酶)表达。
3MET协同第三代头孢菌素对PA抗菌增效作用的机制可能与抑制PA外排泵基因(mexA)和群体感应基因(lasR、rhlR)表达、抑制群体感应信号分子表达、改变PA通透性有关。
1明确二甲双胍(metformin, MET)协同第三代头孢菌素对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)抗菌增效的作用；
2探索MET抗菌增效作用与抑制细菌外排泵基因表达、群体感应基因表达、群体感应信号分子表达及细菌通透性的相关性。
方法
1细菌培养
采用三区平板划线法培养PA，挑取单克隆菌落接种于LB(Luria-Bertani broth)液体培养基中，作为种子培养液。分别吸取一定量种子培养液接种于不同葡萄糖浓度的MH(Mueller-Hinton broth)、PTSB(peptone trypticase soy broth)培养基，置35℃恒温摇床，150rpm培养，检测各组药物对PA的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)、生长曲线、毒力因子表达、外排泵基因表达、群体感应基因及信号分子表达、胞外多糖含量、磷含量的影响。
2实验分组
测定药物对PA的MIC：设空白对照组、第三代头孢菌素组【头孢他啶(ceftazidime, CAZ)、头孢哌酮(cefoperazone, CFP)、头孢曲松(cefatriaxone, CTR)各12个浓度，分别为128μg·mL-1倍比稀释至0.0625μg·mL-1】、MET组(512μg·mL-1倍比稀释至0.25μg·mL-1共12个药物浓度)、第三代头孢菌素(CAZ、CFP、CTR浓度分别为1/4、1/2、1倍MIC)合用MET(512μg·mL-1倍比稀释至0.25μg·mL-1共12个药物浓度)组，考察药物在不同糖浓度(0、2、5、12.5、31.25 mmol·L-1)时对PA的MIC。
测定药物对PA生长曲线的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ浓度分别为32μg·mL-1倍比稀释至0.0156μg·mL-1，CFP、CTR浓度分别为128μg·mL-1倍比稀释至0.0625μg·mL-1)、MET组(512μg·mL-1倍比稀释至0.25μg·mL-1)、第三代头孢菌素(CAZ、CFP、CTR浓度分别为1/8、1/4、1/2、1倍MIC)合用MET(0.25、1、4μg·mL-1)组，考察药物在不同糖浓度(0、2、5、12.5、31.25 mmol·L-1)时对PA生长曲线的作用。
测定药物对PA毒力因子表达的作用：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ、CFP、CTR浓度分别为1/2、2倍MIC)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA毒力因子的作用。
测定药物对PA外排泵及群体感应相关基因表达的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ、CFP、CTR浓度为1/4倍MIC)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA外排泵及群体感应相关基因表达的作用。
测定药物对PA群体感应信号分子的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ0.25μg·mL-1、CFP1μg·mL-1、CTR4μg·mL-1)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA群体感应信号分子表达的作用。
测定药物对PA胞外多糖的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ浓度为0.25μg·mL-1、CFP浓度为1μg·mL-1、CTR浓度为4μg·mL-1)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA胞外多糖含量的作用。
测定药物对PA磷含量的影响：设空白对照组、第三代头孢菌素组(CAZ浓度为0.25μg·mL-1、CFP浓度为1μg·mL-1、CTR浓度为4μg·mL-1)、MET组(1、4μg·mL-1)、第三代头孢菌素合用MET组，考察药物在不同糖浓度(0、5、31.25 mmol·L-1)时对PA磷含量的作用。
3测定指标
3.1微量稀释法测定药物对PA的MIC；
3.2比浊法测定PA生长曲线；
3.3光密度法测定绿脓菌素、弹性蛋白酶、蛋白水解酶表达；
3.4Real-timePCR测定MexA、MexX、MexD、lasR、rhlR基因表达；
3.5细菌生物感应器测定群体感应信号分子表达；
3.6苯酚硫酸法测定胞外多糖含量；
3.7磷钼蓝比色法测定磷含量。
结果
1CAZ对PA的MIC为1μg·mL-1，CFP对PA的MIC为4μg·mL-1，CTR对PA的MIC为16μg·mL-1；实验浓度下，MET无抑制PA的作用且不改变第三代头孢菌素对PA的MIC；药物对PA的MIC不受葡萄糖浓度的影响。
2葡萄糖浓度依赖性促进PA生长。MET浓度依赖地协同第三代头孢菌素抑制PA生长。
3葡萄糖浓度依赖性促进PA毒力因子表达，MET浓度依赖地协同第三代头孢菌素抑制PA毒力因子表达。
4葡萄糖浓度依赖性促进PA外排泵基因(MexA)、群体感应基因(lasR、rhlR)的表达；MET浓度依赖地抑制MexA、lasR、rhlR表达，并协同第三代头孢菌素抑制lasR、rhlR表达。
5MET协同第三代头孢菌素抑制PA群体感应信号分子、胞外多糖及磷含量。
结论
1在高糖状态下，MET(0.25、1、4μg·mL-1)协同第三代头孢菌素具有浓度依赖性抑制PA生长的作用。
2MET(1、4μg·mL-1)浓度依赖性协同第三代头孢菌素抑制PA随葡萄糖浓度正相关增加的毒力因子(包括PA绿脓菌素、PA蛋白水解酶、PA弹性蛋白酶)表达。
3MET协同第三代头孢菌素对PA抗菌增效作用的机制可能与抑制PA外排泵基因(mexA)和群体感应基因(lasR、rhlR)表达、抑制群体感应信号分子表达、改变PA通透性有关。