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目的:非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)对化疗产生耐药行为是临床治疗失败的主要原因之一，而多靶点抗叶酸代谢药物培美曲塞(pemetrexed，PEM)作为NSCLC的一线治疗药物，其耐药现象频繁发生，但其耐药机制至今仍不甚清楚。本研究旨在探讨泛素羧基端酯酶L1(ubiquitincarboxyl-terminal hydrolase L1，UCHL1)在NSCLC中PEM耐药的作用，阐明UCHL1介导PEM耐药的关键机制。
方法:收集63例NSCLC患者的肿瘤组织标本，采用免疫组织化学检测UCHL1蛋白的表达情况，分析其表达水平与NSCLC病理特征、患者预后和新辅助化疗效果的关系;利用R2基因分析和可视化平台和KaplanMeier-plotter数据库分析了NSCLC患者中UCHL1表达水平与患者病理特征、患者预后和新辅助化疗效果的关系。体外采用高浓度间歇诱导法以PEM诱导和建立NSCLC耐药细胞株，采用CCK-8和克隆形成实验检测细胞的耐药性和稳定性;Westernblot及免疫荧光检测耐药细胞中UCHL1蛋白的变化;利用shRNA敲减技术或抑制剂干预UCHL1表达或活性后，检测耐药细胞对化疗药物敏感性的变化，Western-blot和流式细胞术检测各处理组中细胞周期相关蛋白和细胞周期变化，Western-blot和real-timePCR检测各处理组中DNA损伤和修复基因和蛋白的表达变化;检测耐药细胞中胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，TS)表达变化;再过表达TS以恢复细胞中TS表达，检测细胞中细胞周期和DNA损伤的变化。建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察在PEM和UCHL1抑制剂刺激下的成瘤能力，运用Western-blot、real-timePCR和免疫组织化学检测各组移植瘤UCHL1与耐药相关标志蛋白的表达情况。
结果:在肿瘤组织样本里，UCHL1的表达与患者性别、年龄、分化程度、组织学分型及TNM分期均无明显相关性，但与NSCLC耐药呈正相关;同时，UCHL1表达越高，患者生存时间越短。分析TCGA数据库中220例肺腺癌患者，UCHL1高表达的患者主要表现为治疗无效;KaplanMeier-plotter数据库中，肺腺癌患者的UCHL1表达水平与患者总生存时间呈现显著负相关性。体外成功诱导出NSCLC肺腺癌PEM耐药细胞株，H1299和A549耐药细胞株的耐药指数分别是23.99和23.51，耐药的细胞株稳定性较好。在耐药细胞株中检测到UCHL1表达明显增高，而使用shRNA敲减技术或抑制剂干预UCHL1后，耐药细胞株对PEM及顺铂的敏感性提高。相比于亲本株细胞，耐药细胞应对PEM刺激后，CyclinD1和c-Myc蛋白水平仍较高，细胞周期无明显变化，表明其可维持细胞周期进展;同时，γH2AX表达无明显变化，ERCC1表达增强，表明其DNA损伤修复能力提高。而干预耐药细胞中UCHL1后，PEM可引起耐药细胞的细胞周期停滞和DNA损伤增加。进一步，我们发现UCHL1可上调TS的表达，在敲低UCHL1的H1299耐药细胞中再恢复TS的表达水平，则可以维持耐药细胞的细胞周期进展和激活DNA损伤修复，降低其对PEM和顺铂的敏感性。在H1299耐药细胞建立的裸鼠皮下移植瘤模型中，联合给予PEM和UCHL1抑制剂可以有效抑制肿瘤的大小;Western-blot和免疫组化分析显示，抑制UCHL1活性后，TS的蛋白表达水平和mRNA转录水平均显著性降低，而联合使用UCHL1抑制剂和PEM可增加细胞的DNA损伤和抑制细胞增殖。
结论:本研究揭示了NSCLC中UCHL1的表达水平与PEM耐药存在正相关的规律;UCHL1可通过上调TS的表达，维持细胞周期进展和激活DNA损伤修复能力，介导NSCLC细胞增殖，参与了NSCLC的PEM耐药过程。通过干预UCHL1可通过引起细胞周期停滞和DNA损伤来提高耐药细胞对PEM的药物敏感性，为逆转NSCLC中抗叶酸代谢药物耐药开拓了新思路、提供了新靶点。
方法:收集63例NSCLC患者的肿瘤组织标本，采用免疫组织化学检测UCHL1蛋白的表达情况，分析其表达水平与NSCLC病理特征、患者预后和新辅助化疗效果的关系;利用R2基因分析和可视化平台和KaplanMeier-plotter数据库分析了NSCLC患者中UCHL1表达水平与患者病理特征、患者预后和新辅助化疗效果的关系。体外采用高浓度间歇诱导法以PEM诱导和建立NSCLC耐药细胞株，采用CCK-8和克隆形成实验检测细胞的耐药性和稳定性;Westernblot及免疫荧光检测耐药细胞中UCHL1蛋白的变化;利用shRNA敲减技术或抑制剂干预UCHL1表达或活性后，检测耐药细胞对化疗药物敏感性的变化，Western-blot和流式细胞术检测各处理组中细胞周期相关蛋白和细胞周期变化，Western-blot和real-timePCR检测各处理组中DNA损伤和修复基因和蛋白的表达变化;检测耐药细胞中胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase，TS)表达变化;再过表达TS以恢复细胞中TS表达，检测细胞中细胞周期和DNA损伤的变化。建立裸鼠皮下移植瘤模型，观察在PEM和UCHL1抑制剂刺激下的成瘤能力，运用Western-blot、real-timePCR和免疫组织化学检测各组移植瘤UCHL1与耐药相关标志蛋白的表达情况。
结果:在肿瘤组织样本里，UCHL1的表达与患者性别、年龄、分化程度、组织学分型及TNM分期均无明显相关性，但与NSCLC耐药呈正相关;同时，UCHL1表达越高，患者生存时间越短。分析TCGA数据库中220例肺腺癌患者，UCHL1高表达的患者主要表现为治疗无效;KaplanMeier-plotter数据库中，肺腺癌患者的UCHL1表达水平与患者总生存时间呈现显著负相关性。体外成功诱导出NSCLC肺腺癌PEM耐药细胞株，H1299和A549耐药细胞株的耐药指数分别是23.99和23.51，耐药的细胞株稳定性较好。在耐药细胞株中检测到UCHL1表达明显增高，而使用shRNA敲减技术或抑制剂干预UCHL1后，耐药细胞株对PEM及顺铂的敏感性提高。相比于亲本株细胞，耐药细胞应对PEM刺激后，CyclinD1和c-Myc蛋白水平仍较高，细胞周期无明显变化，表明其可维持细胞周期进展;同时，γH2AX表达无明显变化，ERCC1表达增强，表明其DNA损伤修复能力提高。而干预耐药细胞中UCHL1后，PEM可引起耐药细胞的细胞周期停滞和DNA损伤增加。进一步，我们发现UCHL1可上调TS的表达，在敲低UCHL1的H1299耐药细胞中再恢复TS的表达水平，则可以维持耐药细胞的细胞周期进展和激活DNA损伤修复，降低其对PEM和顺铂的敏感性。在H1299耐药细胞建立的裸鼠皮下移植瘤模型中，联合给予PEM和UCHL1抑制剂可以有效抑制肿瘤的大小;Western-blot和免疫组化分析显示，抑制UCHL1活性后，TS的蛋白表达水平和mRNA转录水平均显著性降低，而联合使用UCHL1抑制剂和PEM可增加细胞的DNA损伤和抑制细胞增殖。
结论:本研究揭示了NSCLC中UCHL1的表达水平与PEM耐药存在正相关的规律;UCHL1可通过上调TS的表达，维持细胞周期进展和激活DNA损伤修复能力，介导NSCLC细胞增殖，参与了NSCLC的PEM耐药过程。通过干预UCHL1可通过引起细胞周期停滞和DNA损伤来提高耐药细胞对PEM的药物敏感性，为逆转NSCLC中抗叶酸代谢药物耐药开拓了新思路、提供了新靶点。