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目的:
本课题所选复方黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略·血痹虚劳病脉证治》篇，为治血痹专方。以黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣为组方，考察黄芪桂枝五物汤入脑入血成分，为后续实验指标性成分的选择提供依据及复方药效物质基础研究提供参考;考察黄芪桂枝五物汤在大鼠体内药代动力学过程，探讨复方中指标性成分在体内的代谢规律;建立在体微透析方法，以考察大鼠灌胃黄芪桂枝五物汤后，指标性成分在正常大鼠及脑缺血损伤大鼠的药代动力学过程，探讨正常与病理状态下黄芪桂枝五物汤中指标性成分在体内及脑组织中的代谢差异，为黄芪桂枝五物汤用于治疗脑中风提供给药指导。
方法:
1黄芪桂枝五物汤吸收入脑及入血成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析
采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对正常大鼠脑组织、血浆和脑缺血损伤大鼠脑组织、血浆进行分析，为该复方药效物质基础研究提供参考。
2黄芪桂枝五物汤在正常大鼠血浆中的药动学研究
建立HPLC-MS/MS测定血浆中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷及芍药苷的含量，采用眼眶取血法进行黄芪桂枝五物汤在正常大鼠血浆中的药动学研究。
3毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素血液和脑在体微透析方法的建立
建立毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素的HPLC检测方法，采用增、减量法考察流速、温度及药物浓度对毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素探针体外回收率的影响以及进行探针体内回收率的稳定性研究。
4黄芪桂枝五物汤在正常与脑缺血损伤大鼠的药动学研究
建立毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素的HPLC-MS/MS检测方法，采用微透析法进行黄芪桂枝五物汤在正常及脑缺血损伤大鼠血液和脑局部药动学的研究。
结果:
1黄芪桂枝五物汤吸收入脑及入血成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析
正常大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤提取物后，脑组织中检测到3个化合物，初步鉴定为6-姜辣素、脱苯甲酰白藜芦醇、黄芪甲苷;血浆中检测到4个化合物，初步鉴定为姜辣素，6-姜辣素、(3-甲氧基-5H-9，11-二氧杂[3，4]庚[1，2-f]茚-7-基])甲醇、(3R)-7，2-羟基-9，10-二甲基紫檀(3R)-7，2-羟基-3，4-二甲基-异黄酮。脑缺血损伤大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤提取物后，脑组织中检测到5个化合物，初步鉴定为毛蕊异黄酮苷、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷、无刺枣苄苷、芒柄花素、6”-O-乙酰基-(6αR，11αR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡糖苷;血浆中检测到3个化合物，初步鉴定为黄芪甲苷、芍药苷和6-姜辣素。
2黄芪桂枝五物汤在正常大鼠的血浆药动学研究
建立的HPLC-MS/MS分析方法中，芍药苷的定量限为15ng/ml，检测限为4.55ng/mL，线性范围为:15～1200ng/mL;毛蕊异黄酮苷的定量限为5.91ng/ml，检测限为1.77ng/mL，线性范围为:15～1800ng/mL;毛蕊异黄酮的定量限为20.4ng/ml，检测限为6.12ng/mL，线性范围为:100～1200ng/mL。
大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，芍药苷、毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮在体内的药代动力学过程采用非房室模型进行拟合，由药代动力学参数可知，大鼠在灌胃给药后，黄芪桂枝五物汤中芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮的t1/2分别为76.67±24.63、207.79±59.88及153.52±68.74min，Cmax分别为16191±2111.38、1120.63±285.88及1497.42±322.66ng/ml;Tmax分别为18.75±7.5、30.00及30.00min;AUC0-t分别为1190795.00±491010.10、79863.97±16460.34及98577.39±21625.63ng/ml*min。
3芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素血液和脑在体微透析方法的建立
随着灌流速度增加，芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素血液及脑探针体外回收率逐渐降低，但与药物的浓度或者温度均无明显相关性。当流速为1.5μL/min时，芍药苷血液和脑探针RR分别为(81.13±3.18)％和(34.28±4.56)％，毛蕊异黄酮苷血液和脑探针RR分别为(78.31±2.60)％和(71.99±8.06)％，毛蕊异黄酮血液和脑探针RR分别为(51.59±3.15)％和(53.02±1.35)％，6-姜辣素血液和脑探针RR分别为(52.16±2.30)％和(43.31±2.98)％。芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素血液及脑探针体内回收率在10h内保持相对稳定。
4黄芪桂枝五物汤在正常与脑缺血损伤大鼠的药动学研究
大鼠灌胃给药后，黄芪桂枝五物汤中芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素在血液及脑局部的药代动力学过程采用非房室模型进行拟合。
芍药苷:Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood、t1/2brain，CLblood及表观分布容积(Vbrain)均具有统计学意义，相对于正常组大鼠，模型组大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood均增加，CLblood，t1/2brain及Vbrain均减小。毛蕊异黄酮苷:Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood、CLblood、Cmaxbrain及MRTbrain均具有统计学意义，相对正常组大鼠，模型组大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood、AUC0-tblood及AUC0-infblood及MRTbrain均降低，而清除率CLblood及Cmaxbrain增加。毛蕊异黄酮:Vblood、Cmaxblood及Vbrain具有统计学意义，相对于正常大鼠，模型大鼠在灌胃给药黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood降低，Vblood及Vbrain增加。6-姜辣素:Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood、CLblood及MRTbrain均具有统计学意义。相对正常组大鼠，模型组大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood及MRTbrain均降低，CLblood提高。
结论:
脑缺血损伤可影响药物在体内的代谢过程，增加芍药苷及6-姜辣素在血液中的含量，降低毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮血液中的含量，影响芍药苷及毛蕊异黄酮在脑内的表观分布容积，毛蕊异黄酮苷和6-姜辣素脑内滞留时间。在正常及脑缺血损伤大鼠中，芍药苷及6-姜辣素在血液中的相对含量高于脑组织，而毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮在脑组织中的相对含量高于血液，提示毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮具有高组织分布特性。
本课题所选复方黄芪桂枝五物汤出自《金匮要略·血痹虚劳病脉证治》篇，为治血痹专方。以黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣为组方，考察黄芪桂枝五物汤入脑入血成分，为后续实验指标性成分的选择提供依据及复方药效物质基础研究提供参考;考察黄芪桂枝五物汤在大鼠体内药代动力学过程，探讨复方中指标性成分在体内的代谢规律;建立在体微透析方法，以考察大鼠灌胃黄芪桂枝五物汤后，指标性成分在正常大鼠及脑缺血损伤大鼠的药代动力学过程，探讨正常与病理状态下黄芪桂枝五物汤中指标性成分在体内及脑组织中的代谢差异，为黄芪桂枝五物汤用于治疗脑中风提供给药指导。
方法:
1黄芪桂枝五物汤吸收入脑及入血成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析
采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对正常大鼠脑组织、血浆和脑缺血损伤大鼠脑组织、血浆进行分析，为该复方药效物质基础研究提供参考。
2黄芪桂枝五物汤在正常大鼠血浆中的药动学研究
建立HPLC-MS/MS测定血浆中毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷及芍药苷的含量，采用眼眶取血法进行黄芪桂枝五物汤在正常大鼠血浆中的药动学研究。
3毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素血液和脑在体微透析方法的建立
建立毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素的HPLC检测方法，采用增、减量法考察流速、温度及药物浓度对毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素探针体外回收率的影响以及进行探针体内回收率的稳定性研究。
4黄芪桂枝五物汤在正常与脑缺血损伤大鼠的药动学研究
建立毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芍药苷及6-姜辣素的HPLC-MS/MS检测方法，采用微透析法进行黄芪桂枝五物汤在正常及脑缺血损伤大鼠血液和脑局部药动学的研究。
结果:
1黄芪桂枝五物汤吸收入脑及入血成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析
正常大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤提取物后，脑组织中检测到3个化合物，初步鉴定为6-姜辣素、脱苯甲酰白藜芦醇、黄芪甲苷;血浆中检测到4个化合物，初步鉴定为姜辣素，6-姜辣素、(3-甲氧基-5H-9，11-二氧杂[3，4]庚[1，2-f]茚-7-基])甲醇、(3R)-7，2-羟基-9，10-二甲基紫檀(3R)-7，2-羟基-3，4-二甲基-异黄酮。脑缺血损伤大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤提取物后，脑组织中检测到5个化合物，初步鉴定为毛蕊异黄酮苷、芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖苷、无刺枣苄苷、芒柄花素、6”-O-乙酰基-(6αR，11αR)-9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡糖苷;血浆中检测到3个化合物，初步鉴定为黄芪甲苷、芍药苷和6-姜辣素。
2黄芪桂枝五物汤在正常大鼠的血浆药动学研究
建立的HPLC-MS/MS分析方法中，芍药苷的定量限为15ng/ml，检测限为4.55ng/mL，线性范围为:15～1200ng/mL;毛蕊异黄酮苷的定量限为5.91ng/ml，检测限为1.77ng/mL，线性范围为:15～1800ng/mL;毛蕊异黄酮的定量限为20.4ng/ml，检测限为6.12ng/mL，线性范围为:100～1200ng/mL。
大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，芍药苷、毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮在体内的药代动力学过程采用非房室模型进行拟合，由药代动力学参数可知，大鼠在灌胃给药后，黄芪桂枝五物汤中芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮的t1/2分别为76.67±24.63、207.79±59.88及153.52±68.74min，Cmax分别为16191±2111.38、1120.63±285.88及1497.42±322.66ng/ml;Tmax分别为18.75±7.5、30.00及30.00min;AUC0-t分别为1190795.00±491010.10、79863.97±16460.34及98577.39±21625.63ng/ml*min。
3芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素血液和脑在体微透析方法的建立
随着灌流速度增加，芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素血液及脑探针体外回收率逐渐降低，但与药物的浓度或者温度均无明显相关性。当流速为1.5μL/min时，芍药苷血液和脑探针RR分别为(81.13±3.18)％和(34.28±4.56)％，毛蕊异黄酮苷血液和脑探针RR分别为(78.31±2.60)％和(71.99±8.06)％，毛蕊异黄酮血液和脑探针RR分别为(51.59±3.15)％和(53.02±1.35)％，6-姜辣素血液和脑探针RR分别为(52.16±2.30)％和(43.31±2.98)％。芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素血液及脑探针体内回收率在10h内保持相对稳定。
4黄芪桂枝五物汤在正常与脑缺血损伤大鼠的药动学研究
大鼠灌胃给药后，黄芪桂枝五物汤中芍药苷、毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮及6-姜辣素在血液及脑局部的药代动力学过程采用非房室模型进行拟合。
芍药苷:Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood、t1/2brain，CLblood及表观分布容积(Vbrain)均具有统计学意义，相对于正常组大鼠，模型组大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood均增加，CLblood，t1/2brain及Vbrain均减小。毛蕊异黄酮苷:Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood、CLblood、Cmaxbrain及MRTbrain均具有统计学意义，相对正常组大鼠，模型组大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood、AUC0-tblood及AUC0-infblood及MRTbrain均降低，而清除率CLblood及Cmaxbrain增加。毛蕊异黄酮:Vblood、Cmaxblood及Vbrain具有统计学意义，相对于正常大鼠，模型大鼠在灌胃给药黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood降低，Vblood及Vbrain增加。6-姜辣素:Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood、CLblood及MRTbrain均具有统计学意义。相对正常组大鼠，模型组大鼠在灌胃黄芪桂枝五物汤后，Cmaxblood、AUC0-tblood、AUC0-infblood及MRTbrain均降低，CLblood提高。
结论:
脑缺血损伤可影响药物在体内的代谢过程，增加芍药苷及6-姜辣素在血液中的含量，降低毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮血液中的含量，影响芍药苷及毛蕊异黄酮在脑内的表观分布容积，毛蕊异黄酮苷和6-姜辣素脑内滞留时间。在正常及脑缺血损伤大鼠中，芍药苷及6-姜辣素在血液中的相对含量高于脑组织，而毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮在脑组织中的相对含量高于血液，提示毛蕊异黄酮苷及毛蕊异黄酮具有高组织分布特性。