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研究目的
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一种病因不明的慢性免疫性疾病。人们普遍认为IBD是环境因素作用于遗传易感者引起的，随着肠道菌群的参与，肠道免疫系统和非免疫系统被激活，最终导致自身免疫性炎症。IBD的自身免疫性与T淋巴细胞免疫反应密切相关，特别是与肠粘膜中辅助性T细胞(helper T cell，Th)及其亚群失衡有关。因此，从调节Th细胞及亚群平衡和自噬的角度阐明药物对IBD的作用机制，对IBD的免疫治疗具有重要意义。
血红栓菌(Pycnoporus sanguineus (L.)Murrill)是一种食用菌，国外民间医学及现有研究显示，血红栓菌具有抗肿瘤、提高免疫力、抗炎等作用，可用于治疗关节炎、痛风、止血、喉咙痛、溃疡、牙龈疼痛、发烧和出血等疾病。本研究从调节Th细胞及其亚群平衡和自噬的角度，初步探讨血红栓菌多糖(polysaccharide of P.sanguineus，PPS)治疗硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium，DSS)诱导的IBD模型的作用机制，为科学阐释PPS抗炎物质基础提供理论依据。
方法
1.以气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)联用分析PPS的单糖组成，凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography，GPC)分析PPS的相对分子量，聚氰基丙烯酸正丁酯(Butyleyanoacrylate，BCA)法测定其蛋白质含量，苯酚-硫酸法测定其多糖含量;
2.取雄性BALB/c小鼠，设正常(N)组，模型(M)组，美沙拉嗪组(5-ASA，400 mg/kg)，血红栓菌多糖组(PPS，100、200、400 mg/kg)。实验共观察14天，从第8天开始，除N组外，其余各组通过自由饮用3％DSS溶液以建立IBD模型，N组自由饮用蒸馏水。PPS组从第1天开始灌胃给药，连续14天;5-ASA组从第8天开始灌胃给药，连续7天;N组及M组给予等体积蒸馏水;
3.实验期间，观察和记录小鼠体重、粪便以及便血情况，并以体重变化、粪便性状、血便/便血情况建立疾病活动指数(Disease Activity Index，DAI)评分体系，评价受试动物病情。实验第15天，剖取各组小鼠肛门至盲肠段结肠，对结肠组织炎症进行宏观评分(Macroscopic Score，MS);
4.通过苏木精-伊红(Haematoxylin and Eosin，H&E)染色法分析结肠组织的损伤情况，同时通过免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测分析结肠组织增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)的表达情况。应用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测结肠组织的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性变化及应用液相芯片技术检测组织中IL-12p40、IL-15、IL-10、IL-17、MCP-1β、MIP-1β的含量。此外，应用ELISA检测血清中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的含量;
5.应用蛋白质印迹法(Western Blot，WB)检测小鼠结肠组织中连接蛋白ZO-1、E-Cadherin及自噬相关蛋白ULK1、p62、Beclin-1、LC3I、LC3Ⅱ的表达，以分析结肠损伤屏障的修复情况;
6.应用流式细胞术(Flowcytometry Analysis，FCM)检测小鼠结肠组织中Th细胞中IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3表达率，分析Th1、Th2、Th17及Treg的比例，以分析结肠组织中Th细胞的分化状态。
结果
1.PPS的多糖含量为74％，蛋白质含量为25％;PPS相对分子质量的范围为5000～6.7×105Da;PPS主要是由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖。
2.在DSS刺激下，与N组相比，M组小鼠出现体重明显下降、稀/血便等体征，DAI评分及结肠宏观评分明显上升，结肠明显缩短;而给予PPS治疗后，PPS组小鼠的体重回升，DAI评分及宏观评分明显下降，且其结肠长度明显延长。
3.H&E染色结果表明M组结肠结构出现如肠上皮损伤、肠隐窝模糊、粘膜下层及肌层水肿等明显损伤，PCNA的表达明显受到抑制;PPS可明显改善结肠组织的损伤，且明显提高了PCNA的表达。
4.WB结果表明，M组的结肠上皮连接蛋白ZO-1、E-Cadherin的表达显著降低，自噬蛋白LC3I、LC3Ⅱ、ULK1、Beclin-1和p62的表达也出现明显降低，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值增加;PPS可使连接蛋白表达上升，对LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1和p62的表达也有明显的促进作用，且明显降低了LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值。M组血清中LPS的含量明显高于N组，而PPS治疗后，血清中LPS的含量明显降低。
5.M组结肠组织的MPO的含量明显高于N组，M组结肠组织分泌的细胞因子IL-12p40、IL-15、MCP-1β和MIP-1β明显升高;而PPS组血清中MPO的含量明显降低，且细胞因子IL-10、IL-15、IL-17、IL-12p40的分泌受到抑制，而MCP-1β的分泌增加。
6.对结肠组织Th淋巴细胞及其亚群分析显示，M组的Th细胞及其亚群的比例明显增加;PPS(200和400mg/kg)能显著降低Th细胞的比例，降低促炎亚群(Th2、Th17)及Treg的比例，但显著升高Th1比例。
结论
血红栓菌多糖可明显提高IBD模型动物结肠的连接蛋白(ZO-1，E-cadherin)的表达，缓解其肠道炎症反应，减少炎症细胞浸润，提高病变组织中连接蛋白的表达，抑制超活化自噬，促进结肠粘膜愈合。血红栓菌多糖还能减少致炎性Th细胞及降低促炎亚群Th2、Th17和免疫抑制性的Treg在病灶中的浸润，从而抑制炎症因子的分泌，调节机体内免疫平衡。上述实验结果提示，血红栓菌多糖对DSS诱导的IBD具有明显的治疗作用，该作用与其减缓IBD活动期间炎症反应、修复肠上皮屏障、逆转超活化自噬及调节机体免疫平衡密切相关，提示血红栓菌在IBD预防与治疗中具有潜在的药用价值。
炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一种病因不明的慢性免疫性疾病。人们普遍认为IBD是环境因素作用于遗传易感者引起的，随着肠道菌群的参与，肠道免疫系统和非免疫系统被激活，最终导致自身免疫性炎症。IBD的自身免疫性与T淋巴细胞免疫反应密切相关，特别是与肠粘膜中辅助性T细胞(helper T cell，Th)及其亚群失衡有关。因此，从调节Th细胞及亚群平衡和自噬的角度阐明药物对IBD的作用机制，对IBD的免疫治疗具有重要意义。
血红栓菌(Pycnoporus sanguineus (L.)Murrill)是一种食用菌，国外民间医学及现有研究显示，血红栓菌具有抗肿瘤、提高免疫力、抗炎等作用，可用于治疗关节炎、痛风、止血、喉咙痛、溃疡、牙龈疼痛、发烧和出血等疾病。本研究从调节Th细胞及其亚群平衡和自噬的角度，初步探讨血红栓菌多糖(polysaccharide of P.sanguineus，PPS)治疗硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium，DSS)诱导的IBD模型的作用机制，为科学阐释PPS抗炎物质基础提供理论依据。
方法
1.以气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS)联用分析PPS的单糖组成，凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography，GPC)分析PPS的相对分子量，聚氰基丙烯酸正丁酯(Butyleyanoacrylate，BCA)法测定其蛋白质含量，苯酚-硫酸法测定其多糖含量;
2.取雄性BALB/c小鼠，设正常(N)组，模型(M)组，美沙拉嗪组(5-ASA，400 mg/kg)，血红栓菌多糖组(PPS，100、200、400 mg/kg)。实验共观察14天，从第8天开始，除N组外，其余各组通过自由饮用3％DSS溶液以建立IBD模型，N组自由饮用蒸馏水。PPS组从第1天开始灌胃给药，连续14天;5-ASA组从第8天开始灌胃给药，连续7天;N组及M组给予等体积蒸馏水;
3.实验期间，观察和记录小鼠体重、粪便以及便血情况，并以体重变化、粪便性状、血便/便血情况建立疾病活动指数(Disease Activity Index，DAI)评分体系，评价受试动物病情。实验第15天，剖取各组小鼠肛门至盲肠段结肠，对结肠组织炎症进行宏观评分(Macroscopic Score，MS);
4.通过苏木精-伊红(Haematoxylin and Eosin，H&E)染色法分析结肠组织的损伤情况，同时通过免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测分析结肠组织增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)的表达情况。应用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测结肠组织的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性变化及应用液相芯片技术检测组织中IL-12p40、IL-15、IL-10、IL-17、MCP-1β、MIP-1β的含量。此外，应用ELISA检测血清中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的含量;
5.应用蛋白质印迹法(Western Blot，WB)检测小鼠结肠组织中连接蛋白ZO-1、E-Cadherin及自噬相关蛋白ULK1、p62、Beclin-1、LC3I、LC3Ⅱ的表达，以分析结肠损伤屏障的修复情况;
6.应用流式细胞术(Flowcytometry Analysis，FCM)检测小鼠结肠组织中Th细胞中IFN-γ、IL-4、IL-17和Foxp3表达率，分析Th1、Th2、Th17及Treg的比例，以分析结肠组织中Th细胞的分化状态。
结果
1.PPS的多糖含量为74％，蛋白质含量为25％;PPS相对分子质量的范围为5000～6.7×105Da;PPS主要是由核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖。
2.在DSS刺激下，与N组相比，M组小鼠出现体重明显下降、稀/血便等体征，DAI评分及结肠宏观评分明显上升，结肠明显缩短;而给予PPS治疗后，PPS组小鼠的体重回升，DAI评分及宏观评分明显下降，且其结肠长度明显延长。
3.H&E染色结果表明M组结肠结构出现如肠上皮损伤、肠隐窝模糊、粘膜下层及肌层水肿等明显损伤，PCNA的表达明显受到抑制;PPS可明显改善结肠组织的损伤，且明显提高了PCNA的表达。
4.WB结果表明，M组的结肠上皮连接蛋白ZO-1、E-Cadherin的表达显著降低，自噬蛋白LC3I、LC3Ⅱ、ULK1、Beclin-1和p62的表达也出现明显降低，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值增加;PPS可使连接蛋白表达上升，对LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1和p62的表达也有明显的促进作用，且明显降低了LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值。M组血清中LPS的含量明显高于N组，而PPS治疗后，血清中LPS的含量明显降低。
5.M组结肠组织的MPO的含量明显高于N组，M组结肠组织分泌的细胞因子IL-12p40、IL-15、MCP-1β和MIP-1β明显升高;而PPS组血清中MPO的含量明显降低，且细胞因子IL-10、IL-15、IL-17、IL-12p40的分泌受到抑制，而MCP-1β的分泌增加。
6.对结肠组织Th淋巴细胞及其亚群分析显示，M组的Th细胞及其亚群的比例明显增加;PPS(200和400mg/kg)能显著降低Th细胞的比例，降低促炎亚群(Th2、Th17)及Treg的比例，但显著升高Th1比例。
结论
血红栓菌多糖可明显提高IBD模型动物结肠的连接蛋白(ZO-1，E-cadherin)的表达，缓解其肠道炎症反应，减少炎症细胞浸润，提高病变组织中连接蛋白的表达，抑制超活化自噬，促进结肠粘膜愈合。血红栓菌多糖还能减少致炎性Th细胞及降低促炎亚群Th2、Th17和免疫抑制性的Treg在病灶中的浸润，从而抑制炎症因子的分泌，调节机体内免疫平衡。上述实验结果提示，血红栓菌多糖对DSS诱导的IBD具有明显的治疗作用，该作用与其减缓IBD活动期间炎症反应、修复肠上皮屏障、逆转超活化自噬及调节机体免疫平衡密切相关，提示血红栓菌在IBD预防与治疗中具有潜在的药用价值。