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巨噬细胞作为天然免疫细胞和抗原呈递细胞,广泛分布在全身组织中,通过摄取和呈递外来异物、死亡细胞碎片,参与宿主防御和免疫稳态的调节。具有高度异质和可塑性的巨噬细胞随着组织微环境的变化,极化为不同表型,在炎症发生过程中发挥不同的功能。经典激活型（M1型）巨噬细胞主要参与促炎反应,而选择性激活型（M2型）巨噬细胞主要参与抗炎反应。生理情况下,M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的极化保持动态平衡,一旦该平衡被打破,就可能导致疾病发生。因此,在炎症或损伤组织中,调节巨噬细胞M1/M2极化平衡状态,改善炎症环境被认为是治疗炎性相关疾病的有效策略。但是,目前关于巨噬细胞极化的内在调节因子的研究仍然不足。广泛存在于真核生物mRNA中的N6腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m6A）修饰,在甲基化转移酶,读码器和去甲基化酶的作用下,参与发育阻滞和免疫反应等多种生物过程。胰岛素样生长因子2 RNA结合蛋白2（insulin-like growth factor 2 messenger RNA-binding protein 2,IGF2BP2）是高度保守的 RNA结合蛋白,在定位、翻译和稳定性等多个方面调节mRNA的表达。新近研究表明,IGF2BP2作为m6A修饰的读码器,参与多种免疫相关疾病的发展,提示其可能调控机体免疫稳态。巨噬细胞极化调节是免疫稳态维持的关键因素。IGF2BP2是否参与了巨噬细胞极化调节?其是否通过调节巨噬细胞极化参与免疫稳态的维持?迄今未见报道。基于此,我们设计本课题研究IGF2BP2对巨噬细胞极化的调节作用及其机制,并进一步研究IGF2BP2调节的巨噬细胞极化在炎性疾病中的作用。通过研究,我们首次发现了 IGF2BP2参与巨噬细胞极化的调节,并揭示了其发挥作用的分子机制:缺失IGF2BP2一方面促进了脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的M1型巨噬细胞极化,并加重了葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate,DSS）诱导的结肠炎发展;另一方面,抑制了白细胞介素4（Interleukin,IL4）诱导的M2型巨噬细胞极化,且缓和了蟑螂提取物诱导的肺部炎症;MeR]P-qPCR,RIP-seq和RNA-pull down实验表明,IGF2BP2通过m6A依赖的方式靶向结节性硬化复合物（Tuberous sclerosis complex,Tsc1）和过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）,促进 M1 型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化;此外,我们还发现信号传导与转录激活因子6（Signal Transducer and Activatorof Transcription 6,STAT6）通过高迁移率族蛋白 A2（High Mobility Group AT-hook2,HMGA2）上调 IGF2BP2 的表达。这些发现填补了IGF2BP2在调节巨噬细胞极化方面的空白,为靶向巨噬细胞治疗炎性疾病提供了潜在靶点。第一部分IGF2BP2在巨噬细胞极化中的作用研究目的1.分析IGF2BP2在巨噬细胞中的表达情况2.明确IGF2BP2在体内外对巨噬细胞极化的影响研究方法1.采用RT-qPCR和Western blot方法,分析原代培养的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞中IGF2BP2的表达情况。2.采用RT-qPCR方法,检测缺失IGF2BP2后,M1型和M2型巨噬细胞表面标志物的表达情况。3.腹膜腔注射甲壳素（可以促进腹腔内M2型巨噬细胞的募集）,在体内检测IGF2BP2对巨噬细胞极化的作用。研究结果1.用LPS（100ng/ml）和IL4（20ng/ml）分别刺激两种来源的巨噬细胞,结果显示:LPS和IL4都能上调Igf2bp2在巨噬细胞中的转录水平。同时用LPS或IL4分别孵育两种来源的巨噬细胞一定时间,结果显示:IGF2BP2蛋白表达水平与孵育时间呈正相关。2.缺失IGF2BP2后,在LPS诱导的M1型巨噬细胞中Il1β、Ifn-γ、Il12、Il6和Tnf-α表达上调,而在IL4诱导的M2型巨噬细胞中Tgf-β、Arg1、Cd206、Ym1和Fizz1表达减少。3.与对照组相比,缺失IGF2BP2后,甲壳素募集的M2型巨噬细胞中Arg1、Cd206、Fizz1、Pdl2、Tgf-β和Il10的表达明显减少。研究结论IGF2BP2在巨噬细胞极化过程中表达上调,并且可以促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞偏移。第二部分IGF2BP2调节巨噬细胞极化的分子机制研究研究目的1.明确IGF2BP2调节巨噬细胞极化的下游靶基因。2.分析IGF2BP2是否以m6A修饰的方式调控下游靶基因的表达。3.探究IGF2BP2调节的代谢重编程在巨噬细胞极化中的作用机制。研究方法1.在骨髓来源的巨噬细胞中采用iRIP-seq方法分析并筛选与IGF2BP2相结合的靶基因。2.利用药理学方法,选择不同的蛋白抑制剂,借助RT-qPCR和Chip-qPCR,分析调控IGF2BP2表达的上游基因。3.利用Western blot方法,分析缺失IGF2BP2后,骨髓来源的巨噬细胞中,STAT1/MAPK/JNK/ERK/MEK/NF-κB/AKT 通路及 TSC/mTORC1 通路的活化水平。4.利用 MeRIP-qPCR、RNA-pull down、RNA 小干扰和 RIP-qPCR 方法,进一步确认IGF2BP2是否通过甲基化修饰调节下游靶基因的变化。利用RNA半衰期实验,检测IGF2BP2对下游靶基因稳定性的调节作用。5.通过检测骨髓来源的巨噬细胞中氧气消耗速率（O2 consumption rate,OCR）、备用呼吸容量（Sparerespiratory capacity,SRC）和脂肪酸代谢相关基因的表达水平,分析IGF2BP2介导的代谢重编程在巨噬细胞极化中的作用。研究结果1.阻断M2型巨噬细胞中JAK/STAT6信号通路,Igf2bp2表达下降,但阻断PI3K/mTOR信号通路,Igf2bp2表达不受影响。Chip-qPCR提示STAT6蛋白可以与Hmga2结合。Western blot实验表明缺失IGF2BP2,STAT6的磷酸化水平不受影响,但PPARγ表达水平下降,脂肪酸代谢相关基因表达受到抑制。2.在M2型巨噬细胞中,IGF2BP2与Pparγ的甲基化修饰位点相结合。下调Mettl14的表达后,与IGF2BP2蛋白结合的Pparγ减少。RNA半衰期实验发现,与对照组相比,缺失IGF2BP2后,巨噬细胞中Ppary表达减少,稳定性降低。3.在M2型巨噬细胞中缺失IGF2BP2,Tsc1表达水平降低,mTORC1信号通路被激活。应用药理学方法抑制mTORC1信号通路后,可明显逆转因缺失IGF2BP2导致的Fizz1、Tgf-β、Ym1和Cd206等M2型巨噬细胞标志物表达下调的现象。同时,与缺失IGF2BP2现象一致,在M2型巨噬细胞中,下调Tsc1的表达,细胞氧化磷酸化水平降低。4.在M1型巨噬细胞中缺失IGF2BP2,Tsc1和Tsc2表达减少,mTORC1信号通路被激活,但抑制mTORC1信号通路,并不改变炎症性细胞因子的表达水平。此外缺失IGF2BP2,MEK/ERK信号通路被激活,AKT信号通路被抑制,但P38/JNK/NF-κB/STAT1信号通路不受影响。进一步研究发现,抑制MEK/ERK信号通路,可明显逆转因缺失IGF2BP2导致的Ifn-γ、Il1β和Il12等炎症性细胞因子上调的现象。5.在巨噬细胞中,IGF2BP2与Tsc1的m6A甲基化修饰位点相结合。下调Mettl14的表达后,与IGF2BP2蛋白结合的Tsc1减少。RNA半衰期实验发现,与对照组相比,缺失IGF2BP2后,巨噬细胞中Tsc1表达减少,稳定性降低。研究结论1.在巨噬细胞中,Pparγ和Tsc1是IGF2BP2的下游靶基因。2.在M2型巨噬细胞中,STAT6通过调控Hmga2转录,影响IGF2BP2的表达。IGF2BP2以m6A甲基化修饰的方式,增强Ppary的mRNA稳定性,进而影响脂肪酸代谢,促进M2型巨噬细胞极化。3.IGF2BP2以m6A甲基化修饰的方式,增强Tsc1的mRNA稳定性。在M1型巨噬细胞中,IGF2BP2通过作用于Tsc1,调节MEK/ERK信号通路,影响炎症性细胞因子的释放。在M2型巨噬细胞中,IGF2BP2通过作用于Tsc1,调节mTORC1信号通路和巨噬细胞氧化磷酸化水平,进而影响抗炎细胞因子的释放。第三部分IGF2BP2调控的巨噬细胞极化在炎性疾病中的作用研究目的巨噬细胞表型之间的相互转化,在炎症性肠病、哮喘、肿瘤和病毒感染等疾病的发生发展中起关键作用。有研究报道,IGF2BP2失调与某些疾病如糖尿病和肿瘤有关,但在炎症调节中的作用知之甚少。我们的研究结果表明IGF2BP2可以调节巨噬细胞的表型激活。于是我们继续检测IGF2BP2是否通过影响巨噬细胞极化,调节炎性疾病的发展,为靶向巨噬细胞治疗炎性疾病提供新的方向。1.研究IGF2BP2调控的巨噬细胞极化在溃疡性结肠炎中的作用。2.研究IGF2BP2调控的巨噬细胞极化在哮喘中的作用。研究方法1.通过免疫荧光方法检测IGF2BP2、CD68、F4/80、CD206和iNOS等指标在组织中的表达情况。2.取同窝的野生小鼠和缺失IGF2BP2的转基因小鼠,连续饮用7天2.5%DSS,制备溃疡性结肠炎模型,通过炎症相关指标评估IGF2BP2对结肠炎的保护作用。并进一步通过IGF2BP2嵌合体小鼠确认骨髓来源的IGF2BP2是否可以改善溃疡性结肠炎的进展。3.选取雌性IGF2BP2骨髓嵌合体小鼠,鼻腔给予20μg蟑螂提取物（CRE）,制备哮喘模型,并通过HE染色、流式细胞术及RT-qPCR分析骨髓来源的IGF2BP2在哮喘中的作用。研究结果1.人类结肠炎组织中表达IGF2BP2和CD68,且在CD68+的巨噬细胞中表达IGF2BP2蛋白。与野生小鼠相比,缺失IGF2BP2的转基因小鼠溃疡性结肠炎程度更为严重:基因缺陷小鼠体重下降及结肠缩短程度,DAI评分及炎症组织学评分,肠炎组织中Il1β、Il6、Il17、Ifn-γ和Il10等促炎细胞因子表达,CD68+iNOS+巨噬细胞数量等指标均显著高于对照组小鼠。将野生小鼠的骨髓注射到缺失IGF2BP2的转基因小鼠中,能显著改善溃疡性结肠炎的程度。2.人类哮喘样本的CD68+巨噬细胞中表达IGF2BP2蛋白。在蟑螂提取物诱导的四种嵌合体小鼠哮喘模型中,骨髓中含有IGF2BP2的嵌合体小鼠病情更严重:肺泡灌洗液中巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞数量更高,肺组织中M2型巨噬细胞标志物Arg1、Cd206、Fizz1、Ym1和Il10表达更高,F4/80+CD206+巨噬细胞数量更多。研究结论1.在DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中,缺失IGF2BP2,可促进巨噬细胞向M1方向极化,加重炎症的进展;补充骨髓来源的IGF2BP2后,可有效改善这种现象。2.在CRE诱导的哮喘模型中,骨髓来源的IGF2BP2可促进巨噬细胞向M2方向极化,加重哮喘的发生发展。