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上皮性卵巢癌（epithelial ovarian carcinoma,EOC）是女性生殖系统三大常见恶性肿瘤之一,多见于中老年女性,约占卵巢恶性肿瘤发病率的90%。因恶性程度高且早期EOC症状隐匿,约60～70%的患者在明确诊断时,已达肿瘤晚期（Ⅲ-Ⅳ期）,因此预后较差。目前EOC标准的初始治疗原则为手术为主,辅以化疗等的综合治疗。鉴于EOC对化疗较敏感,这使得化疗在其治疗中占有很大权重。铂类联合紫杉醇的化疗方案为“金标准”一线化疗用药。紫杉醇（paclitaxel,PTX）可抑制肿瘤细胞微管蛋白的合成和解聚,对上皮性卵巢癌具有良好的治疗性作用;但是晚期、复发性及难治性EOC患者常继发紫杉醇耐药,进而加速肿瘤进展,增加肿瘤病死率。目前,关于紫杉醇耐药的发生机制尚不十分清楚,有研究提示自噬可能为紫杉醇耐药发生机制之一。自噬是细胞内发生的一种保守性进化现象,普遍认为是细胞的一种自我防护机制;启动自噬可使细胞耐受应激,减少死亡。目前大量研究发现化疗耐药患者瘤细胞中多可见较高水平的自噬潮,而抑制自噬可增加瘤细胞化疗敏感性,促进细胞凋亡。因此,自噬有望成为探索肿瘤治疗的潜在作用靶点。WWOX蛋白为多功能肿瘤抑制因子,但由于其基因内脆性位点的存在,瘤细胞中常见WWOX的异常表达。既往文献证明WWOX磷酸化及核转移为其介导凋亡的前提条件。鉴于此,先前的实验研究往往围绕WWOX与肿瘤细胞凋亡及增殖抑制间的关系展开。近年来,有研究发现在舌癌中,WWOX可参与自噬调节,进而促进瘤细胞化疗凋亡。但WWOX是否在不同种类瘤细胞中均能够发挥对自噬的抑制性调控作用,尚需更多、更有力的证据支持。雷帕霉素哺乳动物作用靶点（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其参与调节细胞代谢、促进细胞增殖。mTOR与Raptor等因子组成复合物mTORC1及mTORC2,其中mTORCl参与的mTOR通路已被大量研究证实可参与细胞自噬潮的调节。WWOX作为肿瘤研究领域内的热点分子之一,其是否能在紫杉醇作用下的EOC细胞中发挥促进凋亡、调节mTOR通路并抑制瘤细胞自噬的作用,尚需进一步研究证实。另外,紫杉醇在EOC细胞中除了诱导凋亡,其是否也参与了细胞自噬的调节;同时这种调节的方向如何;另外,自噬水平的改变是否也参与了紫杉醇耐药的发生;这些疑问均需找到相对应的答案。为了回答上述这些问题,我们展开了对紫杉醇作用下EOC细胞内WWOX与凋亡、自噬以及mTOR通路间关系的研究,这对于明晰紫杉醇在EOC中的可能耐药机制以及给未来医学提供可改善EOC临床预后的分子治疗候选基因均具有一定的意义。本课题的具体研究内容包括以下三个部分:1.WWOX在EOC中的表达及对紫杉醇所诱导的上皮性卵巢癌细胞凋亡的调节作用2.紫杉醇及WWOX对上皮性卵巢癌细胞自噬潮的影响3.WWOX通过mTOR/P70S6K信号通路抵抗紫杉醇及对上皮性卵巢癌细胞自噬潮的调节第一部分WWOX在上皮性细胞中的表达及对紫杉醇所诱导的上皮性卵巢癌细胞凋亡的调节作用研究目的紫杉醇作为EOC的一线化疗药物,其机制被认为是破坏细胞微管蛋白。紫杉醇可使微管蛋白二聚体失去动态平衡,并且诱导与促进微管蛋白的聚合、微管装配以及防止其解聚,从而稳定微管并抑制瘤细胞有丝分裂,并最终触发细胞凋亡。人WWOX基因在应激或者凋亡诱导因子的作用下,其第33位酪氨酸被磷酸化,进而与p53和JNK1结合形成复合物参与细胞凋亡调控。WWOX的磷酸化及核转移被认为是WWOX介导凋亡的前提条件。在多种人肿瘤细胞中,WWOX均被证实可参与细胞的增殖抑制和凋亡促进。本部分内容旨在通过研究紫杉醇对EOC细胞增殖及细胞凋亡的作用、紫杉醇对EOC细胞中WWOX及p-WWOX表达的影响,以及WWOX对EOC凋亡的影响,来探究WWOX对紫杉醇诱导EOC细胞凋亡的调控性作用。同时再次验证既往的研究结论:WWOX为肿瘤抑制性因子,其激活为凋亡的前提条件。另外,通过研究WWOX在不同EOC细胞株中的表达情况,分析其基础状态下表达的意义。研究内容及方法1.选取人EOC细胞株:A2780细胞,SKOV3细胞及紫杉醇耐药细胞A2780/T细胞进行培养,并使用蛋白免疫印迹分析法（Western blot）检测这三种细胞株中WWOX蛋白的基础表达水平。2.分别使用相应浓度的紫杉醇处理上述3种EOC细胞,对细胞增殖及凋亡进行相关检测。包括:CCK-8（Cell Counting Kit-8 test）试验、光镜下细胞增殖和凋亡评估（进一步对细胞增殖进行柱状图量化分析）以及流式细胞术（凋亡细胞率的评估）。3.使用紫杉醇处理A2780细胞及A2780/T细胞后,应用蛋白免疫印迹分析法（Western blot）检测WWOX、p-WWOX以及凋亡相关蛋白caspase-3（包括cleaved-caspase-3）,PARP（包括 cleaved-PARP）的表达。进一步的,使用逆转录荧光定量实验（Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）在mRNA水平分析EOC细胞经紫杉醇处理后的WWOX表达变化趋势。4.构建WWOX过表达载体（质粒）,验证转染效率后,转染A2780细胞。使用紫杉醇分别处理转染前及后的A2780细胞,再次行流式细胞检测分析细胞凋亡率。研究结果1.在EOC细胞中,紫杉醇耐药A2780/T细胞的WWOX（基础）表达水平最高,紫杉醇最为敏感的A2780细胞的WWOX表达水平居中,而形态上细长类似间质细胞的SKOV3细胞WWOX表达水平最低。2.CCK-8实验提示:紫杉醇抑制敏感EOC细胞（A2780细胞及SKOV3细胞）增殖,并诱导凋亡;但对耐药细胞A2780/T无效,且A2780/T细胞表现出随紫杉醇浓度增高后的增殖加速现象。3.光镜细胞观察实验:光镜下可见A2780及SKOV3细胞随紫杉醇处理时间出现凋亡细胞增多,增殖抑制,存活细胞减少。随机选取光镜下5个视野进行存活细胞的量化柱状图分析提示:A2780及SKOV3细胞存活细胞比例随紫杉醇作用时间显著减少;而A2780/T细胞存活细胞比例渐升高。4.Western blot结果示:在A2780细胞中,WWOX表现为紫杉醇剂量依赖性及时间依赖性上调,WWOX被激活,表现为p-WWOX表达量渐升高。同时可见凋亡蛋白cleaved caspase-3及cleaved PARP表达量渐增高。在A2780/T细胞中,WWOX的表达呈紫杉醇处理剂量及时间依赖性下调;p-WWOX表达恒定,与紫杉醇处理时间无关,同时凋亡蛋白无表达。RT-PCR实验结果显示:经紫杉醇作用后,A2780细胞中WWOX的RNA表达上调,A2780/T细胞的WWOX RNA表达下调。5.构建的WWOX过表达载体,经western blot实验验证转染效果（结果提示:转染后的A2780细胞表达量明显增高）。A2780细胞转染WWOX组及空质粒组使用150ng/ml紫杉醇处理48h后经流式细胞术检测紫杉醇作用后的细胞凋亡比例,结果提示WWOX高表达可显著增敏紫杉醇诱导:A2780组:46.4%,WWOX-A2780 组:63.6%。研究结论1.WWOX在A2780/T细胞中表达量最高,在SKOV3中表达量最低。提示耐药细胞A2780/T中可能存在WWOX蛋白失活的异常表达情况,或者相关拮抗因子的存在。既往研究认为WWOX具有上皮-间质细胞转化抑制性作用,由此,形态学上具有间质细胞特征的SKOV3细胞具有最低的WWOX表达量是可以理解的。2.紫杉醇可诱导敏感性EOC细胞凋亡,但对耐药细胞无效。3.WWOX表达增高及激活（p-WWOX）后紫杉醇方可诱导EOC细胞凋亡。4.上调WWOX可增敏紫杉醇对EOC细胞的凋亡诱导性作用。第二部分紫杉醇及WWOX对上皮性卵巢癌细胞自噬潮的影响研究目的导致紫杉醇在EOC中耐药的发生机制目前尚未被完全阐明。既往研究发现肿瘤细胞较正常细胞往往表现为自噬水平的增强,而抑制自噬可在很大程度上削弱瘤细胞的增殖活性并促进肿瘤细胞化疗凋亡。目前相关研究发现自噬参与多种化疗药物耐药,抑制自噬有望成为攻克肿瘤耐药的新靶点。2015年关于舌癌的一项研究提示WWOX蛋白可抑制自噬的发生。因此,本部分研究旨在前期的实验（明确WWOX促凋亡作用）基础上,探讨WWOX是否会对EOC细胞产生自噬抑制性作用;并期望进一步明确WWOX在抗肿瘤领域内的作用及分子学意义。另外,通过研究紫杉醇对EOC细胞自噬水平的影响,探讨EOC细胞紫杉醇耐药的可能发生机制。研究内容及方法1.应用Western blot实验检测经紫杉醇作用下（A2780 150ng/ml及A2780/T 1600ng/ml）0,6,12,24,48 及 72h EOC 细胞中自噬关键蛋白 Beclin-1、Atg12-5、LC3（Ⅰ,Ⅱ）以及自噬作用底物P62的表达。2.使用自噬抑制剂氯喹（chloroquine,CQ）,抑制自噬（溶酶）体降解。使用Western blot分别检测NC、CQ、CQ+紫杉醇及紫杉醇作用下A2780细胞的LC3Ⅱ的表达情况。3.使用包含红-绿荧光标记的LC3蛋白的腺病毒（GFP-mRFP-LC3）经预实验找出最佳感染条件后,感染A2780及A2780/T细胞。使用共聚焦显微镜（confocal microscopy）观察转染细胞分别经150ng/ml及1600ng/ml紫杉醇处理后红绿荧光的变化情况。4.使用透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）分别观察A2780及A2780/T细胞分别经150ng/ml及1600ng/ml紫杉醇处理后自噬泡数目及改变。5.构建WWOX敲除转染载体（质粒）,验证效力后,转染A2780细胞。使用Western blot法检测LC3（Ⅰ,Ⅱ）及Beclin-1在WWOX水平改变后的表达情况。研究结果1.紫杉醇可上调EOC细胞中的自噬相关性蛋白表达。经紫杉醇作用后,A2780细胞及A2780/T细胞均表现为自噬相关性关键蛋白:Beclin-1,Atg12-5及LC3 Ⅱ的表达水平的时间依赖性增高及自噬作用底物P62的时间依赖性表达下调。2.氯喹（CQ）的使用验证了紫杉醇诱导自噬的真实性。我们使用氯喹验证了紫杉醇诱导自噬发生的真实性:使用CQ后LC3 Ⅱ表达增高,再此基础上叠加使用紫杉醇作用后,LC3Ⅱ的表达进一步增高。3.共聚焦电子显微镜观察结果:经紫杉醇处理后,A2780及A2780/T细胞中均表现为红、绿荧光光点的数目增多及体积增大;这种改变在A2780中尤为明显。另外实验显示,耐药细胞A2780/T未经紫杉醇处理前即表现为LC3荧光光点的明显增多（明显高于A2780细胞）。4.透射电子显微镜观察性实验显示,耐药细胞A2780/T的基础自噬体数目明显多于A2780细胞。经紫杉醇处理后,A2780及A2780/T细胞中自噬体数目均可见增多,提示自噬水平升高。5.上调A2780细胞中的WWOX表达后,自噬相关性蛋白LC3 Ⅱ及Beclin-1表达明显下调,提示WWOX对自噬的抑制性作用。研究结论1.紫杉醇耐药EOC细胞的基础自噬水平明显升高,提示自噬参与紫杉醇耐药发生机制。2.紫杉醇可上调EOC细胞的自噬潮,提示自噬升高,为紫杉醇治疗后EOC的耐药发生创造了一定的条件。3.WWOX可抑制EOC细胞自噬的发生,为肿瘤耐药的治疗提供分子治疗基础。第三部分WWOX通过mTOR/P70S6K信号通路抵抗紫杉醇对上皮性卵巢癌细胞自噬潮的调节研究目的雷帕霉素哺乳动物作用靶点（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,其可调节细胞代谢、促进细胞增殖。mTOR可与Raptor等因子组成复合物mTORC1及其作用底物构成的mTOR/P70S6K通路已被证实可调节自噬潮的发生。本部分实验旨在通过研究紫杉醇与mTOR/P70S6K通路间的关系,探讨在EOC细胞中紫杉醇调控自噬的可能机制;同时分析WWOX与mTOR间的关系,推验WWOX对紫杉醇所产生细胞效应的调控性作用,为WWOX参与分子水平逆转肿瘤的化疗耐药提供新的体外实验研究理论基础。研究内容及方法1.在A2780细胞和A2780/T细胞中,应用Western blot分别检测150ng/ml及 1600ng/ml 紫杉醇作用下 0、6、12、24、48、72h 后 mTOR 通路（mTOR-p70S6K通路）中mTOR、p-mTOR、p-P70S6K及p-4E-BP-1的蛋白表达水平。通过分析该通路中各个因子与紫杉醇的作用关系,探讨紫杉醇在此两种细胞中对mTOR通路的调控作用,并进一步探讨紫杉醇调控自噬的可能机制。2.构建WWOX敲除转染载体（质粒）,验证效力后,与前部分实验中构建的WWOX过表达载体分别转染该实验中选择出的2种EOC细胞。使用Western blot法分析mTOR、p-mTOR在WWOX水平改变后的变化趋势。从而推测WWOX对mTOR通路的可能调节效应,进而结合第二部分实验结论分析WWOX抵抗紫杉醇提升EOC自噬的可能机制。研究结果1.紫杉醇抑制EOC敏感细胞及耐药细胞的mTOR/p70S6K通路Western blot实验结果显示:经紫杉醇作用后,A2780细胞（敏感细胞）及A2780/T细胞（耐药细胞）均表现为mTOR/p70S6K通路的抑制,具体表现为:p-mTOR的紫杉醇处理时间依赖性下调,p-P70S6K的始终无表达状态及p-4E-BP-1紫杉醇作用时间依赖性表达上调。2.WWOX可抵抗紫杉醇对mTOR通路的抑制性作用转染实验Western blot实验结果显示:上调WWOX后,p-mTOR表达增加;而这种对p-mTOR的调控性效应可抵抗紫杉醇对p-mTOR的下调。相反,敲除WWOX后,p-mTOR呈下调表达。研究结论1.无论在紫杉醇敏感及耐药的EOC细胞中,紫杉醇均可抑制mTOR/P70S6K通路。进而推测,紫杉醇是通过mTOR/P70S6K通路的调控性作用发挥对EOC细胞中自噬水平的调节。2.WWOX可能通过介导mTOR/P70S6K通路与紫杉醇产生竞争性效应,从而降低EOC细胞的自噬水平,进而显示多功能的抑瘤效应。