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卵巢癌是全球范围女性中最常见的致命性恶性肿瘤之一,也是严重威胁妇女生命和健康的疾病。目前,针对于卵巢癌尚缺乏有效的早期筛查和诊断方法,导致75%的卵巢癌患者在确诊时已处于疾病的晚期阶段,因此造成卵巢癌病人多失去根治性手术的机会,而只能以肿瘤细胞减灭术作为最终的治疗方案。所以,化疗在卵巢癌的治疗过程中起着举足轻重的作用。晚期卵巢癌患者能够存活到5年的概率小于30%,而多达80%的患者会在两年左右复发。因此,卵巢癌的致死率位居妇科恶性肿瘤之首。在临床上,卵巢癌的标准治疗方法是手术联合紫杉醇（Paclitaxel,PTX）和铂类药物的辅助化疗。但是,随着治疗的不断进行,大部分的卵巢癌患者会产生化疗耐药,最终导致治疗的失败,预后不良。目前,有关铂类耐药的研究受到了广泛的关注,但紫杉醇同样在临床应用中受到耐药问题的影响,并因此限制了其应用,但是有关其耐药的机制尚不完全明确。因此,阐明卵巢癌耐药机制并克服这一困扰广大临床医生的难题,对于改善卵巢癌的治疗和预后具有重要意义。C-C-基序趋化因子配体20（CCL20）是 C-C-基序趋化因子受体 6（C-C motif chemokine receptor 6,CCR6）的配体,在肺癌、结直肠癌和甲状腺癌等多种类型癌症的发生、发展中起着关键作用,CCL20/CCR6在肿瘤细胞耐药过程中同样起着十分重要的作用。有研究指出:顺铂可以刺激巨噬细胞分泌CCL20,并通过CCL20/CCR6轴促进卵巢癌细胞发生定向迁移。同时,有学者发现SKOV3细胞中CD44和CD117的表达水平增加与细胞的球形成能力,EMT作用、细胞的转移和多药耐药能力的增强显著相关。但是,CCL20/CCR6在CD44+CD117+细胞对包括PTX在内的化疗药物的耐药过程中发挥的作用以及相关的具体机制尚未明确,需要进一步实验阐明。本研究拟从人卵巢癌SKOV3细胞中分离出卵巢癌CD44+CD117+细胞亚群,在验证并明确CD44+CD117+亚群细胞的细胞干性和对紫杉醇的耐药性的基础上,进一步通过细胞和动物模型阐明CCL20/CCR6在调控CD44+CD117+细胞紫杉醇耐药中的作用及其机制,为研究卵巢癌PTX耐药的机制和临床治疗提出新的见解。第一部分CD44+CD117+卵巢癌细胞干性及其对紫杉醇的耐药性分析研究目的:培养上皮性卵巢癌细胞,分离CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞亚群,明确CD44+CD117+和CD44-CD117-亚群细胞干性及其对紫杉醇的耐药性。研究方法:（1）培养人卵巢癌细胞系SKOV-3,通过磁珠筛选法,利用CD44+和CD117+抗体结合磁珠分离获得CD44+CD117+和CD44-CD117-卵巢癌细胞亚群,进一步通过流式细胞仪检测细胞亚群的分布。（2）利用qRT-PCR在mRNA水平上检测Oct4和CCR6在CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞亚群的表达;Western blot在蛋白质水平检测Oct4、CCR6、Notch1、ABCG1在CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞亚群的表达水平并做半定量分析。（3）通过CCK-8细胞活力测定法检测CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞亚群在PTX处理24h和48h的IC50。（4）利用细胞成球实验检测CD44+CD117+和CD44-CD117-亚群细胞的成球能力。（5）通过二氯荧光素二乙酸盐法测定CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞亚群在PTX处理48h后活性氧（ROS）的水平。（6）CCK-8、流式细胞仪和 Hoechst 分别检测CD44+CD117+和 CD44-CD117-细胞的增殖和凋亡。研究结果:（1）流式细胞仪检测:用CD44+磁珠分离卵巢癌SKVO3细胞株中CD44+和CD44-细胞,流式细胞仪检测CD44+细胞占比分别为98.9%和0.2%,表明CD44-和CD44+亚群细胞分离成功;分别在CD44+和CD44-细胞中利用CD117+磁珠分离获得CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞,流式细胞仪检测其占比分别为98.5%和99.5%,表明CD44+CD117+及CD44-CD117-卵巢癌细胞亚群成功分离。（2）qRT-PCR结果:与CD44-D117-细胞亚群相比,Oct4和CCR6在CD44+CD117+细胞亚群的mRNA表达显著提高（P＜0.0001和P＜0.001）;Western blot 结果:Oct4、CCR6、Notch1和 ABCG1 在 CD44+CD117+细胞亚群的表达显著高于CD44-CD117-细胞亚群（P＜0.001）。（3）CCK-8分析细胞IC50结果:CD44+CD117+亚群细胞在24 h（10.22 nM）和48 h（5.04 nM）对 PTX 的 IC50值均高于 CD44-D117-亚群 24 h（4.99 nM）和 48 h（2.51 nM）的 IC50值。（4）细胞成球实验:与CD44-D117-细胞亚群相比,CD44+CD117+细胞显示出更高的球形成能力。（5）ROS含量分析:在正常情况下,CD44-D117-细胞亚群和CD44+CD117+细胞亚群中ROS的含量无明显差别;在PTX处理后,与CD44-D117-细胞亚群相比,CD44+CD117+细胞亚群中ROS含量出现显著降低。（6）流式细胞仪检测及Hoechst染色分析细胞凋亡:在PTX处理48h后,与CD44-D1 17-细胞亚群相比,CD44+CD117+细胞亚群的细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）;CCK-8细胞计数检测细胞增殖发现:在PTX处理细胞24h,48h和72小时后,CD44+CD117+细胞亚群增值率显著高于CD44-D117-细胞亚群（P＜0.05 和 P＜0.001）。结论:（1）从卵巢癌SKOV-3细胞系中,我们成功分离出CD44+CD1 17+及CD44-CD117-卵巢癌细胞亚群。（2）卵巢癌CD44+CD117+细胞亚群的细胞干性和PTX耐药性均强于CD44-D117-亚群细胞。第二部分在细胞水平明确CCL20/CCR6通过调控Notch1信号通路对卵巢癌CD44+CD117+细胞亚群耐药性的影响研究目的:通过干扰CD44+CD117+亚群细胞中Notch1的表达,探究CD44+CD117+亚群细胞的干性和PTX耐药性的变化,以进一步明确在细胞水平CCL20/CCR6/Notch1在卵巢癌CD44+CD117+细胞亚群干性和PTX耐药性中的作用及其机制。研究方法:（1）筛选获得干扰Notch1表达的特异性siRNA序列,瞬时转染到CD44+CD117+卵巢癌细胞中,通过qRT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平明确特异性siRNA对Notch1表达的影响。（2）应用qRT-PCR在mRNA水平检测在干扰Notch1的CD44+CD117+细胞亚群中Oct4的表达;Western blot在蛋白水平上检测在干扰Notch1的CD44+CD117+细胞中 Oct4、CCR6、Notch1和 ABCG1 表达,并进一步检测CCL20对干性相关mRNA及蛋白的表达情况的影响。（3）通过CCK-8细胞活力测定法检测CCL20处理CD44+CD117+亚群细胞后对PTX的IC50,进一步干扰Notch1后细胞对PTX的IC50。（4）细胞成球实验检测在CCL20处理CD44+CD117+亚群细胞后的成球能力以及干扰Notch1后细胞的成球能力。（5）通过二氯荧光素二乙酸盐法测定CCL20对PTX诱导的CD44+CD117+亚群细胞活性氧（ROS）的水平的影响,以及干扰Notch1后的CD44+CD117+细胞亚群中PTX诱导的ROS水平变化。（6）CCK-8、流式细胞仪和Hoechst分别检测CCL20对PTX诱导的CD44+CD117+亚群细胞的增殖和凋亡情况的影响以及在干扰Notch1的CD44+CD117+亚群细胞中对PTX诱导的增殖和凋亡情况。研究结果:（1）通过qRT-PCR和Western blot分析发现:3个Notch1的SiRNA序列无论在mRNA水平还是蛋白水平,都能成功干扰CD44+CD117+细胞中Notch1的表达,其中si-Notch1-2序列的干扰效果最好（P＜0.05,P＜0.01和P＜0.001）。（2）qRT-qPCR和Western blot分析发现:经过CCL20处理可以显著增加CD44+CD117+细胞中Oct4的表达水平,沉默Notch1可以显著逆转CCL20对Oct4表达的上调作用（P＜0.001）;CCL20显著增加了 CD44+CD117+细胞中Oct4、ABCG1、CCR6的蛋白表达水平,沉默Notch1后显著逆转了 CCL20引起的 Oct4、ABCG1、CCR6 表达的上调作用（P＜0.001 和 P＜0.001）。（3）CCK-8细胞计数结果显示:与对照组（IC50=10.98 nM,4.86 nM）相比,CCL20处理CD44+CD1 17+细胞后在24小时和48小时可显著提高CD44+CD117+细胞（IC50=17.51 nM,8.41 nM）对PTX的IC50;而干扰Notch1后可显著逆转CCL20 对 CD44+CD117+细胞的 IC50（IC50=7.92 nM,4.22 nM）的提高作用。（4）细胞成球实验发现:CCL20可以增加CD44+CD117+细胞的球形成能力,而沉默Notch1后则会显著削弱CCL20的这种促进作用。（5）ROS含量分析显示:CCL20可以降低PTX诱导的CD44+CD117+细胞ROS水平,干扰Notch1可以逆转CCL20的这种减弱作用。（6）流式细胞仪检测及Hoechst染色检测细胞凋亡:CCL20显著降低了 PTX诱导的CD44+CD117+细胞的凋亡（P＜0.0001）;而干扰Notch1可以部分逆转CCL20对PTX诱导凋亡的这种抑制作用（P＜0.001）;CCK-8细胞计数检测细胞增殖:CCL20可以增强PTX诱导的CD44+CD117+细胞的增殖;而干扰Notch1可以逆转CCL20这种增强作用（P＜0.05）。结论:在细胞水平,CCL20/CCR6促进CD44+CD117+细胞的干性和对PTX的耐药性;CCL20/CCR6轴通过Notch1信号通路发挥这一作用。第三部分在动物水平明确CCL20/CCR6通过Notch1信号通路对卵巢癌CD44+CD117+细胞干性和PTX耐药性的影响研究目的:本研究旨在通过构建CD44+CD117+和CD44-CD117-异种移植C57BL/6裸鼠卵巢癌模型,以探究CCL20/CCR6对卵巢癌CD44+CD117+细胞干性和PTX耐药性的影响,在动物水平明确CCL20/CCR6通过Notch1信号通路调控卵巢癌CD44+CD117+细胞亚群干性和PTX耐药性。研究方法:（1）将卵巢癌CD44+CD117+和CD44-CD117-细胞对C57BL/6裸鼠进行异种移植建立小鼠卵巢癌模型,在第1,3,7天对其进行CCL20和/或PTX腹腔注射处理,使用游标卡尺在第3d、7d、14d、21d和28d测量裸鼠体内形成肿瘤的各种经线的大小并称重量,绘制生长曲线。（2）免疫组化检测肿瘤组织CCR6表达,Western blot检测肿瘤组织CCR6、Notch1、Oct4和ABCG1蛋白表达水平。（3）二氯荧光素二乙酸盐法测定各组肿瘤组织中ROS的水平。（4）使用苏木素-伊红（HE）处理肿瘤组织切片,观察染色后的肿瘤组织病理情况。（5）Ki-67免疫组织化学法和Tunnel染色分别检测细胞的增殖和凋亡。研究结果:（1）CD44+CD117+组裸鼠的肿瘤体积和重量显著高于CD44-D117-组;进一步分析发现:PTX治疗后,无论是CD44+CD117+裸鼠组还是CD44-D117-裸鼠组,肿瘤增长均出现增强,CD44+CD117+裸鼠肿瘤的体积（P＜0.01）和重量（P＜0.0001）显著高于CD44-D117-裸鼠组;与PTX单独治疗组相比,PTX联合CCL20处理可显著增加裸鼠肿瘤的体积和重量（P＜0.001）。（2）免疫组化显示:与CD44-D117-组相比,CD44+CD117+组肿瘤细胞中CCR6的表达水平显著提高;与单独PTX组相比,联合CCL20治疗可以显著提高肿瘤中CCR6的表达。Western blot显示:CD44+CD117+组肿瘤细胞Oct4、CCR6、ABCG1和Notch1的表达显著高于CD44-D117-组;CCL20治疗可以显著促进肿瘤组织中Oct4、CCR6、ABCG1和Notchl的表达（P＜0.0001）。（3）ROS含量分析:与CD44-CD117-细胞肿瘤组相比,CD44+CD117+组PTX或PTX+CCL20诱导的细胞ROS水平显著降低。（4）HE染色:与CD44-D117-组相比,CD44+CD117+组的肿瘤显示出具有染色质细胞核和细胞质稀少的小圆形细胞的数量增加;与单独使用PTX处理组相比,无论是CD44-D117-或CD44+CD117+细胞裸鼠模型组,联合CCL20治疗可以显著降低肿瘤细胞分化。（5）免疫组化Ki-67分析发现:与PTX治疗后的CD44-D117-组肿瘤组织相比,CD44+CD117+组的细胞增殖显著增加;CCL20可以增加PTX诱导的CD44+CD117+细胞组和CD44+CD117+细胞组的细胞增殖。（6）TUNEL分析:与CD44-CD117-细胞组相比,PTX诱导的CD44+CD117+组细胞凋亡率显著降低;与PTX组相比,联合CCL20处理后无论是CD44-D117-组,还是CD44+CD117+组的肿瘤组织细胞凋亡出现进一步降低。结论:在动物水平上CCL20/CCR6可以通过调控Notch1信号促进CD44+CD117+亚群癌细胞在体内的干性和成瘤能力,促进卵巢癌CD44+CD117+细胞亚群对PTX的耐药性。