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项目背景和目的目前,在全球及中国,肺癌是发病率、死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%。在美国,55%的患者在首次诊断时已有远处转移,IVA期和IVB期NSCLC的5年生存率分别约为10%和低于1%。晚期肺癌的传统治疗方法主要是化疗,仅能获得有限的生存获益。近年来随着对肺癌分子生物学的深入研究及靶向药物、免疫检查点抑制剂的研发,肺癌的诊疗得到明显提高,但限于目前药物的适应症、耐药性及严重的不良反应等问题,使得仅部分患者获益。因此,寻找新的生物标记物和药物靶点,是肺癌研究的热点。人类ZGRF1是众多解旋酶之一,编码的蛋白包含GRF锌指和跨膜结构域。GRF锌指存在于许多DNA结合蛋白中,选择性剪接导致编码不同亚型的多个转录变体。其在同源重组修复（HR）和DNA链间交联（ICL）修复中发挥重要作用。研究证实ZGRF1敲除细胞对DNA链间交联剂MMC和拓扑异构酶I（TOP1）抑制剂及喜树碱（CPT）敏感,另外,其在体外对乳腺癌干细胞的表型和生物学功能具有正向上调作用,三阴乳腺癌ZGRF1高表达与不良预后相关。但是目前其在非小细胞肺癌发生发展中的具体作用及机制还没有相关研究报道,具有进一步研究的价值。生信分析及肺癌组织芯片免疫组化检测发现ZGRF1在肺癌组织显著高于癌旁组织,其表达水平与临床分期、T分期显著相关,ZGRF1高表达与不良预后相关。体外实验证实ZGRF1能显著促进肺癌细胞的增殖、迁移能力,抑制癌细胞凋亡水平;敲低ZGRF1,显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长;IP-MS蛋白质组学筛选ZGRF1互作蛋白,并经CO-IP验证EIF4A3是ZGRF1互作蛋白;ZGRF1敲低组和对照组细胞、裸鼠移植瘤及人非小细胞肺癌组织信号通路蛋白检测及通路蛋白激活剂实验证实,其可能通过结合EIF4A3蛋白参与调控PI3K/AKT信号通路。本课题通过体内体外实验证实ZGRF1对非小细胞肺癌生物学行为的作用,蛋白组学技术查找互作蛋白及参与调控的信号通路等方面的研究,旨在阐明ZGRF1发挥促癌作用的具体机制,为临床成果转化提供相应的理论依据。[研究目的]探讨ZGRF1在非小细胞肺癌中的差异表达情况,明确非小细胞肺癌中ZGRF1差异表达与临床分期等病理学特征之间的关系。探讨ZGRF1差异表达对于非小细胞肺癌患者的预后价值[研究方法]1.采用生物信息学方法分析ZGRF1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及预后价值。我们采用TCGA官方提供的GDC下载工具选取RNAseq的成对样本数据进行分析。TCGA数据库肺鳞癌和肺腺癌ZGRF1基因表达谱差异性分析采用DESeq2方法,对ZGRF1基因表达水平的差异与临床分期等病理学特征之间的相关性采用Chisq Test进行统计分析。预后分析基于TCGA-LUAD和TCGA-LUSC样本临床信息,采用Kaplan-Meier plotter分析ZGRF1表达在肺癌患者中的预后作用。2.对肺癌组织切片进行免疫组织化学染色检测ZGRF1表达。癌与癌旁组织ZGRF1表达差异性分析采用卡方检验,采用Mann-Whitney U检验及Spearman等级相关性分析ZGRF1在癌组织中的表达水平与临床分期等资料之间的相关性,生存分析采用Kaplan-Meier法（Log-Rank法检验统计量）。[结果]1.ZGRF1基因差异表达情况1)TCGA数据库基因表达谱分析结果:肺鳞癌（log2FC=1.4419p=7.8835e-42）和肺腺癌（log2FC=1.1178 p=2.9534e-19）中ZGRF1基因均有差异表达,肿瘤组织显著高于癌旁组织。2)组织芯片检测结果:84例非小细胞肺癌患者的肿瘤组织ZGRF1表达显著高于癌旁组织（p＜0.001***）。2.ZGRF1基因表达水平与临床病理指标相关性分析1)TCGA肺鳞癌患者癌组织中的ZGRF1表达与临床分期（p=4.0936e-07）、T分期（p=1.2581e-05）等临床病理特征有显著的相关性;在肺腺癌患者癌组织中ZGRF1的表达水平与临床分期（p=2.097e-21）、T分期（p=2.171e-16）、N分期（p=3.233e-15）等均具有显著的相关性。2)组织芯片检测结果:ZGRF1在癌组织中的表达水平与临床分期（p=0.001**）、T分期（p=0.002**）和M分期（p=0.019*）等均有显著的相关性。3.组织芯片生存分析结果:ZGRF1低表达组患者较高表达组有更长的生存期（p=0.030）。[结论]1.非小细胞肺癌肿瘤组织ZGRF1表达上调,显著高于癌旁组织。2.ZGRF1在肺癌组织中的表达水平与临床分期及T分期具有显著的相关性。3.ZGRF1基因高表达与不良预后相关。[研究目的]通过比较H1299细胞株、A549细胞株敲低ZGRF1基因与对照组在细胞增殖、迁移及细胞凋亡等生物学功能方面的变化及其对裸鼠移植瘤生长的影响来研究ZGRF1基因在非小细胞肺癌发生发展中的作用。[研究方法]1.ZGRF1基因敲低慢病毒载体构建及转染NCI-H1299和A549细胞株2.研究敲低ZGRF1基因对肺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响1)CCK8检测检测细胞增殖能力2)细胞划痕实验检测细胞迁移能力2)流式双染检测细胞凋亡率3.裸鼠成瘤实验验证敲低ZGRF1基因在体内对非小细胞肺癌生长方面的影响[结果]1.敲低ZGRF1基因对肺癌细胞的增殖、迁移及凋亡的影响1)与对照组相比,96h后ZGRF1敲低组（shZGRF1组）NCI-H1299和A549细胞增殖能力均显著降低（p＜0.001）;2)与对照组相比,24和48h后shZGRF1组NCI-H1299细胞和A549细胞迁移能力均显著降低（p＜0.001）;3)与对照组相比,shZGRF1组NCI-H1299细胞和A549细胞凋亡率显著升高（p＜0.001）。3.裸鼠成瘤实验验证结果1)与对照组相比,NCI-H1299细胞和A549细胞shZGRF1组的裸鼠移植瘤重量和荧光表达量均有显著降低（p＜0.05）。2)绘制的生长曲线显示,与对照组相比,NCI-H1299细胞和A549细胞敲低组的裸鼠移植瘤生长明显减慢。[结论]我们的研究结果证实了 ZGRF1基因在体外具有促进癌细胞增殖、迁移的能力,并有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。裸鼠移植瘤动物实验进一步证实ZGRF1基因在体内也具有促进非小细胞肺癌生长的作用,该基因可能是非小细胞肺癌的一种新的功能驱动因素和一种潜在的预后标志物,具有进一步研究的价值。[研究目的]通过IP-MS蛋白组学技术检测ZGRF1的互作蛋白,并用CO-IP对筛选出的蛋白进行验证,来确定ZGRF1互作蛋白,以便进一步探索ZGRF1对非小细胞肺癌增殖、迁移及凋亡的调控机制。[研究方法]1.构建带3*Flag-ZGRF1过表达慢病毒载体质粒并包装成慢病毒载体转染NCI-H1299 细胞。2.IP-MS蛋白质组学技术检测ZGRF1互作蛋白。3.GO分析和KEGG信号通路富集分析协助筛选ZGRF1互作蛋白。4.String蛋白互作数据库查询ZGRF1互作蛋白。5.Co-IP验证蛋白互作。[结果]确定EIF4A3为ZGRF1互作蛋白[结论]证实EIF4A3是ZGRF1互作蛋白,ZGRF1可能通过结合EIF4A3蛋白促进了肺癌细胞增殖和迁移能力及抑制癌细胞凋亡。[研究目的]进一步探索ZGRF1结合EIF4A3复合物调控下游信号通路的分子机制,为探寻ZGRF1可能作为一种新的生物标记物或药物靶点提供理论依据。[研究方法]1.细胞信号通路蛋白表达检测:WB分别检测NCI-H1299细胞和A549细胞空质粒对照组（shCtr1）、ZGRF1 敲低组（shZGRF1）共 4 组细胞 ZGRF1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、P38、p-P38、PI3K、p-PI3K 蛋白表达。2.信号通路激活剂实验WB分别检测NCI-H1299细胞和A549细胞空质粒对照组（shCtr1）、ZGRF1敲低组（shZGRF1）、空质粒对照组（shCtr1）+AKT激活剂、ZGRF1敲低组（shZGRF1）+AKT 激活剂共 8 组 ZGRF1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、P38、p-P38、PI3K、p-PI3K蛋白表达。3.裸鼠移植瘤信号通路蛋白表达检测:WB检测裸鼠移植瘤组织ZGRF1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT表达（NCI-H1299细胞和A549细胞两种细胞ZGRF1基因敲低组和对照组共4组建立的动物模型）。4.临床肺癌组织信号通路蛋白表达情况检测:WB检测4例临床非小细胞肺癌组织和配对癌旁组织 ZGRF1、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、P38、p-P38、PI3K、p-PI3K蛋白表达。[结果]1.四组细胞下游信号通路蛋白表达结果:1)NCI-H1299细胞信号通路蛋白检测结果:与shCtr1相比,shZGRF1组的ZGRF1、p-AKT、p-PI3K蛋白表达下调,p-P38蛋白表达上调,p-ERK蛋白无明显变化。2)A549 细胞:与 shCtr1 相比,shZGRF1 组的 ZGRF1、p-AKT、p-ERK、p-P38、p-PI3K蛋白表达均下调。2.信号通路AKT激动剂实验结果2.1 NCI-H1299细胞AKT激活剂实验结果;1)与 shCtrl 相比,shCtr1+AKT 激活剂组的 p-AKT、p-P38、ZGRF1、p-ERK 蛋白表达下调,p-PI3K蛋白无明显变化。2)与shZGRF1相比,shZGRF1+AKT激活剂组的p-PI3K、p-P38蛋白表达下调,p-AKT、p-ERK、ZGRF1蛋白表达上调。2.2 A549细胞AKT激动剂实验结果:1)与shCtrl相比,shCtr1+AKT激活剂组的p-AKT、ZGRF1蛋白表达下调,p-PI3K、p-ERK蛋白表达上调,p-P38蛋白表达无明显变化。2)与shZGRF1相比,shZGRF1+AKT激活剂组的p-ERK蛋白表达下调,p-PI3K、ZGRF1蛋白表达上调,p-AKT、p-P38蛋白表达无明显变化。3.裸鼠移植瘤组织下游信号通路蛋白表达（NCI-H1299细胞和A549细胞）1)NCI-H1299 细胞移植瘤:与 shCtrl 相比,shZGRF1 组的 p-PI3K、ZGRF1 蛋白表达下调,p-AKT蛋白表达上调。2)A549 细胞移植瘤:与 shCtr1 相比,shZGRF1 组的 ZGRF1、p-AKT、p-PI3K 蛋白表达下调。4.临床肺癌组织信号通路蛋白表达情况检测p-AKT、p-ERK、p-P38、p-PI3K的表达水平与ZGRF1的表达水平一致。[结论]ZGRF1可能通过结合EIF4A3蛋白参与调控PI3K/AKT信号通路,进而调控非小细胞肺癌的增殖、迁移和凋亡,促进肺癌组织在体内的生长。因此我们认为ZGRF1可能是非小细胞肺癌的一种新的生物标记物和一个潜在的药物靶点。