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[研究目的]
从整体、细胞及分子水平探讨内质网应激JNK、CHOP凋亡通路及内质网应激通路和氧化应激、线粒体损伤途径的相互作用对糖尿病大鼠和高糖条件下原代培养的海马神经元的损伤机制，同时观察中药复方脑复聪的干预效应。
[研究方法]
第一部分动物实验:建立糖尿病大鼠模型，分为模型对照(DM)组、NFC低剂量(NFCL)组、NFC中剂量(NFC-M)组、NFC高剂量(NFC-H)组、正常对照(Con)组。成模后NFC-L组、NFC-M组、NFC-H组分别灌胃不同剂量(0.724g/kg/d, 1.448g/kg/d，2.896g/kg/d)脑复聪;DM组和Con组灌服蒸馏水。对各组大鼠在治疗前及治疗后4周、8周、12周进行血糖检测。12周后行Morris水迷宫及Y迷宫测试进行学习记忆的测定，TUNEL法观察海马神经元凋亡，Westernblot法及实时荧光定量-PCR法检测大鼠脑海马组织JNK、CHOP、Bcl2表达。
第二部分细胞实验:建立新生大鼠海马神经元原代培养体系;设置正常对照组(25mmol/L葡萄糖)及50、75、100、125、150mmol/L不同浓度葡萄糖的条件培养基，采用MTT法摸索高糖对原代海马神经元的最佳作用时间和最适宜作用浓度;分为正常对照(Con)组、高糖(HG)组、脑复聪低剂量(NFC-L)组、脑复聪中剂量(NFC-M)组、脑复聪高剂量(NFC-H)组、CHOPsi-RNA干扰(CHOP si-RNA)组、JNK特异性抑制剂SP600125(JNK-inhibition)组和氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)组。利用si-RNA干扰技术沉默CHOP基因表达。Westernblot法检测Con组、HG组、NFC-H组、NFC-M组、NFC-L组中海马神经元CHOP、Bcl2、JNK蛋白的表达以及CHOPsi-RNA干扰组中海马神经元Bcl2和CHOP的蛋白表达。同时检测JNK抑制剂组中JNK蛋白的表达和NAC干预组中海马神经元CHOP、Bcl2蛋白的表达。实时荧光定量-PCR技术检测Con组、HG组、NFC-H组、NFC-M组、NFC-L组中海马神经元CHOP、Bcl2mRNA的表达以及CHOPsi-RNA干扰组中神经元Bcl2mRNA的表达。同时检测JNK抑制剂SP600125组中JNKmRNA的表达和NAC干预组中海马神经元CHOP、Bcl2mRNA的表达。应用TUNEL法和AnnexinV/PI/Hoechst三染法检测各组神经元凋亡率。DCFH-DA荧光探针和JC-1荧光探针分别检测各组中海马神经元ROS变化和线粒体膜电位的变化。
第三部分中药复方脑复聪代谢物质谱数据库的建立:采用高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HRMS)技术建立中药复方脑复聪颗粒及脑复聪含药血清在人体内的代谢产物及代谢物谱。
[实验结果]
第一部分动物实验:
1.血糖:造模后各组大鼠血糖比Con组均显著升高(P＜0.01)。与DM组相比，各治疗组血糖在各时间点均无明显差异(P＞0.05)。
2.Morris水迷宫实验:与Con组相比，DM组潜伏期明显延长(P＜0.05);NFC-H组潜伏期较DM组缩短(P＜0.05)。
3.Y迷宫实验:与Con组相比，DM组大鼠的正确率下降(P＞0.05);与DM组相比，各剂量NFC组正确率均有所提高，但无统计学差异(P＞0.05)。
4.海马神经元凋亡:与Con组相比，DM组海马组织神经元表现出凋亡的特征。NFC-H组、NFC-M组对高糖导致的形态变化有一定恢复作用。
5.海马JNK、CHOP、Bcl2的表达:DM组海马JNK、CHOP蛋白及基因表达均增加(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05)，Bcl2蛋白及基因表达降低(P＜0.001，P＜0.01)。NFC-H组、NFC-M组大鼠海马组织JNK、CHOP蛋白及基因表达下降(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05);NFC-L组大鼠大脑海马组织JNK、CHOP蛋白表达下降(P＜0.01)。NFC-H组可上调Bcl2蛋白及基因表达水平(P＜0.001，P＜0.05);NFC-M组可上调Bcl2蛋白表达水平(P＜0.01)。
第二部分细胞实验:
1.利用差速贴壁、密度梯度离心、加入阿糖胞苷等方法纯化海马神经元，成功培养新生SD大鼠海马神经元，经鉴定纯度可达95％。
2.海马神经元凋亡率:与Con组相比，HG组中海马神经元凋亡率升高(P＜0.01)。各剂量NFC干预组、CHOPsi-RNA组、JNK抑制剂组及NAC组中海马神经元凋亡率明显降低(P＜0.01)，各药物干预组间海马神经元凋亡率无统计学差异(P＞0.05)。
3.海马神经元JNK、CHOP、Bcl2的蛋白及mRNA表达:和Con组相比，HG组JNKmRNA及蛋白、CHOPmRNA及蛋白增高，Bcl2mRNA及蛋白降低(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05)。与HG组相比，NFC-H组、NFC-M组及CHOPsi-RNA干扰组、JNK抑制剂SP600125组和NAC组JNK、CHOP蛋白表达显著F降(P＜0.001);NFC-H组及CHOPsi-RNA干扰组、JNK抑制剂SP600125组和NAC组Bcl-2蛋白表达均显著升高(P＜0.001)。和HG组相比，NFC-H组、NFC-M组、CHOPsi-RNA干扰组、NAC组、JNK抑制剂SP600125组JNKmRNA表发均显著降低(P＜0.01));NFC-H组、CHOPsi-RNA干扰组、NAC组、JNK抑制剂SP600125组CHOPmRNA表达均显著降低(P＜0.001或P＜0.01);NFC-H、NAC组、CHOPsi-RNA干扰组Bcl2mRNA表达均显著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。
4.海马神经元ROS水平:与Con组相比，HG组ROS平均荧光强度值升高(P＜0.001)。与HG组相比，NFC-H组、NFC-M组、NAC组、JNK抑制剂SP600125组及CHOPsi-RNA干扰组海马神经元ROS的平均荧光强度均显著降低(P＜0.001)。NFC-H、NFC-M组与NAC组、JNK抑制剂组及CHOPsi-RNA组无显著差别(p＞0.05)。
5.海马神经元线粒体膜电位:HG组海马神经元红/绿荧光强度比值较Con组显著降低(P＜0.05)。与HG组相比，NFC-H、NAC组、JNK抑制剂SP600125组、CHOPsi-RNA干扰组海马神经元红/绿荧光强度比值均显著升高(P＜0.01或P＜0.001)。
第三部分中药复方脑复聪代谢物质谱数据库的建立:
对脑复聪颗粒及脑复聪含药血清中的化合物进行高分辨质谱分析，获得它们的高分辨质谱数据，推测其分子组成，并且针对脑复聪颗粒及含药血清中的化合物进行多级质谱碎裂分析。本实验共采集到83种化合物，目前通过网络数据库查找推测出可能结构的化合物共29种。
[结论]
第一部分动物实验:
1.一次性腹腔注射STZ60mg/kg建立糖尿病大鼠模型，12周后，糖尿病模型组大鼠Morris水迷宫实验潜伏期显著延长，糖尿病认知功能障碍大鼠模型成功建立。2.糖尿病大鼠脑海马组织JNK、CHOP蛋白及基因表达水平显著升高，Bcl2蛋白及基因表达显著下降。3.中药复方脑复聪干预可显著改善上述变化，具有改善糖尿病大鼠认知功能的作用。抑制脑海马内质网应激、减少细胞凋亡是其作用的重要途径之一。
第二部分细胞实验:
1.体外高糖环境可激活内质网应激CHOP和JNK凋亡通路诱导海马神经元损伤，且高糖环境下内质网应激通路可以通过氧化应激、线粒体损伤途径的相互作用加重海马神经元损伤。2.脑复聪含药血清可以降低海马神经元凋亡率，对高糖诱导的内质网应激JNK、CHOP凋亡通路有抑制作用，同时还可以降低ROS表达水平，升高线粒体膜电位的水平。
第三部分中药复方脑复聪代谢物质谱数据库的建立:
本文以HPLC-HRMS技术进行中药复方脑复聪的代谢组学分析，建立了脑复聪颗粒及脑复聪含药血清的质谱数据库。
[创新点]从整体、细胞及分子水平探讨内质网应激JNK、CHOP凋亡通路及CHOP通路和氧化应激、线粒体损伤途径交叉通路在糖尿病认知功能障碍中的机制及中药复方脑复聪的干预作用，为阐明糖尿病认知障碍的重要发病机制提供支持，同时也为寻找治疗糖尿病认知障碍的新靶点提供理论依据。
从整体、细胞及分子水平探讨内质网应激JNK、CHOP凋亡通路及内质网应激通路和氧化应激、线粒体损伤途径的相互作用对糖尿病大鼠和高糖条件下原代培养的海马神经元的损伤机制，同时观察中药复方脑复聪的干预效应。
[研究方法]
第一部分动物实验:建立糖尿病大鼠模型，分为模型对照(DM)组、NFC低剂量(NFCL)组、NFC中剂量(NFC-M)组、NFC高剂量(NFC-H)组、正常对照(Con)组。成模后NFC-L组、NFC-M组、NFC-H组分别灌胃不同剂量(0.724g/kg/d, 1.448g/kg/d，2.896g/kg/d)脑复聪;DM组和Con组灌服蒸馏水。对各组大鼠在治疗前及治疗后4周、8周、12周进行血糖检测。12周后行Morris水迷宫及Y迷宫测试进行学习记忆的测定，TUNEL法观察海马神经元凋亡，Westernblot法及实时荧光定量-PCR法检测大鼠脑海马组织JNK、CHOP、Bcl2表达。
第二部分细胞实验:建立新生大鼠海马神经元原代培养体系;设置正常对照组(25mmol/L葡萄糖)及50、75、100、125、150mmol/L不同浓度葡萄糖的条件培养基，采用MTT法摸索高糖对原代海马神经元的最佳作用时间和最适宜作用浓度;分为正常对照(Con)组、高糖(HG)组、脑复聪低剂量(NFC-L)组、脑复聪中剂量(NFC-M)组、脑复聪高剂量(NFC-H)组、CHOPsi-RNA干扰(CHOP si-RNA)组、JNK特异性抑制剂SP600125(JNK-inhibition)组和氧化应激抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)组。利用si-RNA干扰技术沉默CHOP基因表达。Westernblot法检测Con组、HG组、NFC-H组、NFC-M组、NFC-L组中海马神经元CHOP、Bcl2、JNK蛋白的表达以及CHOPsi-RNA干扰组中海马神经元Bcl2和CHOP的蛋白表达。同时检测JNK抑制剂组中JNK蛋白的表达和NAC干预组中海马神经元CHOP、Bcl2蛋白的表达。实时荧光定量-PCR技术检测Con组、HG组、NFC-H组、NFC-M组、NFC-L组中海马神经元CHOP、Bcl2mRNA的表达以及CHOPsi-RNA干扰组中神经元Bcl2mRNA的表达。同时检测JNK抑制剂SP600125组中JNKmRNA的表达和NAC干预组中海马神经元CHOP、Bcl2mRNA的表达。应用TUNEL法和AnnexinV/PI/Hoechst三染法检测各组神经元凋亡率。DCFH-DA荧光探针和JC-1荧光探针分别检测各组中海马神经元ROS变化和线粒体膜电位的变化。
第三部分中药复方脑复聪代谢物质谱数据库的建立:采用高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-HRMS)技术建立中药复方脑复聪颗粒及脑复聪含药血清在人体内的代谢产物及代谢物谱。
[实验结果]
第一部分动物实验:
1.血糖:造模后各组大鼠血糖比Con组均显著升高(P＜0.01)。与DM组相比，各治疗组血糖在各时间点均无明显差异(P＞0.05)。
2.Morris水迷宫实验:与Con组相比，DM组潜伏期明显延长(P＜0.05);NFC-H组潜伏期较DM组缩短(P＜0.05)。
3.Y迷宫实验:与Con组相比，DM组大鼠的正确率下降(P＞0.05);与DM组相比，各剂量NFC组正确率均有所提高，但无统计学差异(P＞0.05)。
4.海马神经元凋亡:与Con组相比，DM组海马组织神经元表现出凋亡的特征。NFC-H组、NFC-M组对高糖导致的形态变化有一定恢复作用。
5.海马JNK、CHOP、Bcl2的表达:DM组海马JNK、CHOP蛋白及基因表达均增加(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05)，Bcl2蛋白及基因表达降低(P＜0.001，P＜0.01)。NFC-H组、NFC-M组大鼠海马组织JNK、CHOP蛋白及基因表达下降(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05);NFC-L组大鼠大脑海马组织JNK、CHOP蛋白表达下降(P＜0.01)。NFC-H组可上调Bcl2蛋白及基因表达水平(P＜0.001，P＜0.05);NFC-M组可上调Bcl2蛋白表达水平(P＜0.01)。
第二部分细胞实验:
1.利用差速贴壁、密度梯度离心、加入阿糖胞苷等方法纯化海马神经元，成功培养新生SD大鼠海马神经元，经鉴定纯度可达95％。
2.海马神经元凋亡率:与Con组相比，HG组中海马神经元凋亡率升高(P＜0.01)。各剂量NFC干预组、CHOPsi-RNA组、JNK抑制剂组及NAC组中海马神经元凋亡率明显降低(P＜0.01)，各药物干预组间海马神经元凋亡率无统计学差异(P＞0.05)。
3.海马神经元JNK、CHOP、Bcl2的蛋白及mRNA表达:和Con组相比，HG组JNKmRNA及蛋白、CHOPmRNA及蛋白增高，Bcl2mRNA及蛋白降低(P＜0.001，P＜0.01或P＜0.05)。与HG组相比，NFC-H组、NFC-M组及CHOPsi-RNA干扰组、JNK抑制剂SP600125组和NAC组JNK、CHOP蛋白表达显著F降(P＜0.001);NFC-H组及CHOPsi-RNA干扰组、JNK抑制剂SP600125组和NAC组Bcl-2蛋白表达均显著升高(P＜0.001)。和HG组相比，NFC-H组、NFC-M组、CHOPsi-RNA干扰组、NAC组、JNK抑制剂SP600125组JNKmRNA表发均显著降低(P＜0.01));NFC-H组、CHOPsi-RNA干扰组、NAC组、JNK抑制剂SP600125组CHOPmRNA表达均显著降低(P＜0.001或P＜0.01);NFC-H、NAC组、CHOPsi-RNA干扰组Bcl2mRNA表达均显著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。
4.海马神经元ROS水平:与Con组相比，HG组ROS平均荧光强度值升高(P＜0.001)。与HG组相比，NFC-H组、NFC-M组、NAC组、JNK抑制剂SP600125组及CHOPsi-RNA干扰组海马神经元ROS的平均荧光强度均显著降低(P＜0.001)。NFC-H、NFC-M组与NAC组、JNK抑制剂组及CHOPsi-RNA组无显著差别(p＞0.05)。
5.海马神经元线粒体膜电位:HG组海马神经元红/绿荧光强度比值较Con组显著降低(P＜0.05)。与HG组相比，NFC-H、NAC组、JNK抑制剂SP600125组、CHOPsi-RNA干扰组海马神经元红/绿荧光强度比值均显著升高(P＜0.01或P＜0.001)。
第三部分中药复方脑复聪代谢物质谱数据库的建立:
对脑复聪颗粒及脑复聪含药血清中的化合物进行高分辨质谱分析，获得它们的高分辨质谱数据，推测其分子组成，并且针对脑复聪颗粒及含药血清中的化合物进行多级质谱碎裂分析。本实验共采集到83种化合物，目前通过网络数据库查找推测出可能结构的化合物共29种。
[结论]
第一部分动物实验:
1.一次性腹腔注射STZ60mg/kg建立糖尿病大鼠模型，12周后，糖尿病模型组大鼠Morris水迷宫实验潜伏期显著延长，糖尿病认知功能障碍大鼠模型成功建立。2.糖尿病大鼠脑海马组织JNK、CHOP蛋白及基因表达水平显著升高，Bcl2蛋白及基因表达显著下降。3.中药复方脑复聪干预可显著改善上述变化，具有改善糖尿病大鼠认知功能的作用。抑制脑海马内质网应激、减少细胞凋亡是其作用的重要途径之一。
第二部分细胞实验:
1.体外高糖环境可激活内质网应激CHOP和JNK凋亡通路诱导海马神经元损伤，且高糖环境下内质网应激通路可以通过氧化应激、线粒体损伤途径的相互作用加重海马神经元损伤。2.脑复聪含药血清可以降低海马神经元凋亡率，对高糖诱导的内质网应激JNK、CHOP凋亡通路有抑制作用，同时还可以降低ROS表达水平，升高线粒体膜电位的水平。
第三部分中药复方脑复聪代谢物质谱数据库的建立:
本文以HPLC-HRMS技术进行中药复方脑复聪的代谢组学分析，建立了脑复聪颗粒及脑复聪含药血清的质谱数据库。
[创新点]从整体、细胞及分子水平探讨内质网应激JNK、CHOP凋亡通路及CHOP通路和氧化应激、线粒体损伤途径交叉通路在糖尿病认知功能障碍中的机制及中药复方脑复聪的干预作用，为阐明糖尿病认知障碍的重要发病机制提供支持，同时也为寻找治疗糖尿病认知障碍的新靶点提供理论依据。