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研究目的及背景:
石斛酚、丁香酸是从名贵中药材石斛中提取出的活性成分，具有良好的抗糖尿病性白内障作用。目前，石斛酚，丁香酸的药理机制已经逐步被阐明，但是其在人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells，HLECs)内的跨膜吸收转运的确切机制尚不清楚。本课题旨在筛选、验证摄取石斛酚、丁香酸进入HLECs的跨膜转运蛋白，考察药物分子与跨膜转运蛋白的相互作用力。
方法:
1.PDB数据库、TCDB和Uniprot蛋白数据库合并Pubmed文献数据库检索在HLECs表达且能够吸收转运药物分子进入细胞内的候选跨膜转运蛋白，同源模建候选转运蛋白的三维结构，利用分子对接实验进一步模拟筛选石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白。
2.通过小干扰RNA(siRNA)沉默候选跨膜转运蛋白，转染孵育72小时后进行实时荧光定量PCR实验(qPCR)和蛋白印迹实验(western blot)实验验证沉默效果，构建候选跨膜转运蛋白瞬时沉默的HLECs细胞。
3.使用高效液相色谱检测沉默候选跨膜转运蛋白的HLECs对石斛酚、丁香酸的吸收量，与正常组HLECs细胞对石斛酚、丁香酸的吸收量比较，筛选转运吸收石斛酚、丁香酸进入HLECs胞内的跨膜转运蛋白。
4.使用原子力扫描探针显微镜在液相力曲线测量模式下进一步考察药物分子与各自跨膜转运蛋白相互作用的粘滞力。
结果:
1.蛋白数据库综合文献检索得到表达于人晶状体上皮细胞的吸收跨膜转运蛋白19个，经过纳入与排除后，得到4个可能的转运蛋白单羧酸转运蛋白12(Monocarboxylate transporter 12，MCT12)、Na(+)/二羧酸共转运体1(Na(+)/dicarboxylatecotransporter1，NaDC1)、钠依赖性磷酸转运蛋白1(Sodium-dependent phosphate transport protein 1，NPT1)和人有机阴离子转运蛋白1(Organic anion transporter 1，OAT1)。石斛酚与MCT12的最低结合能为-5.98kcal/mol，与OAT1的结合能为-4.35kcal/mol，石斛酚与NaDC1和NPT1的结合能分别为-2.34和-1.19kcal/mol。丁香酸分别与MCT12和OAT1的结合能为-5.56和-4.46kcal/mol，丁香酸与NaDC1和NPT1的结合能大小分别为-1.71和-1.22kcal/mol。表明石斛酚、丁香酸与MCT12和OAT1均有较强的结合能力，可能被其转运吸收。因此石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白为MCT12和OAT1。
2.qPCR结果显示沉默后MCT12的基因相对表达量为0.42±0.02，OAT1的基因相对表达为0.60±0.04，与正常组细胞相比，其表达基因表达量显著下降，MCT12的沉默效率约为58％，OAT1的基因沉默效率约为40％，westernblot结果显示MCT12和OAT1的蛋白表达水平相比正常组显著降低。
3.高效液相检测MCT12沉默组HLECs对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.342±0.033μmol/g和0.444±0.031μmol/g;OAT1沉默组对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.609±0.023μmol/g和0.092±0.009μmol/g。正常HLECs对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.570±0.008μmol/g和0.496±0.070μmol/g。与正常细胞对石斛酚的吸收量相比，MCT12沉默组HLECs对石斛酚的吸收量明显减少，而对丁香酸的吸收量无明显改变。与正常细胞对丁香酸的吸收量比较，OAT1沉默组对丁香酸的吸收量明显减少，而对石斛酚的吸收量无明显改变。
4.正常HLECs细胞的粘滞力大小为0.050±0.008nN，石斛酚作用之后细胞粘滞力增加，大小为0.329±0.022nN，与正常细胞粘滞力相比显著增加，当MCT12被沉默再给予石斛酚之后，粘滞力为0.123±0.015nN，与正常细胞+石斛酚组相比显著减少;当丁香酸作用之后细胞粘滞力大小为0.219±0.035nN，与正常组比较显著增加，当OAT1被沉默再给予丁香酸之后，细胞的粘滞力为0.103±0.007nN，与正常细胞+丁香酸组相比显著减少。
结论:
石斛酚在沉默MCT12的细胞吸收量显著减少，丁香酸在沉默OAT1的HLECs的吸收量显著减少，表明石斛酚和丁香酸分别经转运蛋白MCT12和OAT1转运吸收，转运过程中石斛酚与MCT12、丁香酸与OAT1的相互结合和作用力引起细胞粘滞力发生明显改变。
石斛酚、丁香酸是从名贵中药材石斛中提取出的活性成分，具有良好的抗糖尿病性白内障作用。目前，石斛酚，丁香酸的药理机制已经逐步被阐明，但是其在人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells，HLECs)内的跨膜吸收转运的确切机制尚不清楚。本课题旨在筛选、验证摄取石斛酚、丁香酸进入HLECs的跨膜转运蛋白，考察药物分子与跨膜转运蛋白的相互作用力。
方法:
1.PDB数据库、TCDB和Uniprot蛋白数据库合并Pubmed文献数据库检索在HLECs表达且能够吸收转运药物分子进入细胞内的候选跨膜转运蛋白，同源模建候选转运蛋白的三维结构，利用分子对接实验进一步模拟筛选石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白。
2.通过小干扰RNA(siRNA)沉默候选跨膜转运蛋白，转染孵育72小时后进行实时荧光定量PCR实验(qPCR)和蛋白印迹实验(western blot)实验验证沉默效果，构建候选跨膜转运蛋白瞬时沉默的HLECs细胞。
3.使用高效液相色谱检测沉默候选跨膜转运蛋白的HLECs对石斛酚、丁香酸的吸收量，与正常组HLECs细胞对石斛酚、丁香酸的吸收量比较，筛选转运吸收石斛酚、丁香酸进入HLECs胞内的跨膜转运蛋白。
4.使用原子力扫描探针显微镜在液相力曲线测量模式下进一步考察药物分子与各自跨膜转运蛋白相互作用的粘滞力。
结果:
1.蛋白数据库综合文献检索得到表达于人晶状体上皮细胞的吸收跨膜转运蛋白19个，经过纳入与排除后，得到4个可能的转运蛋白单羧酸转运蛋白12(Monocarboxylate transporter 12，MCT12)、Na(+)/二羧酸共转运体1(Na(+)/dicarboxylatecotransporter1，NaDC1)、钠依赖性磷酸转运蛋白1(Sodium-dependent phosphate transport protein 1，NPT1)和人有机阴离子转运蛋白1(Organic anion transporter 1，OAT1)。石斛酚与MCT12的最低结合能为-5.98kcal/mol，与OAT1的结合能为-4.35kcal/mol，石斛酚与NaDC1和NPT1的结合能分别为-2.34和-1.19kcal/mol。丁香酸分别与MCT12和OAT1的结合能为-5.56和-4.46kcal/mol，丁香酸与NaDC1和NPT1的结合能大小分别为-1.71和-1.22kcal/mol。表明石斛酚、丁香酸与MCT12和OAT1均有较强的结合能力，可能被其转运吸收。因此石斛酚、丁香酸的候选跨膜转运蛋白为MCT12和OAT1。
2.qPCR结果显示沉默后MCT12的基因相对表达量为0.42±0.02，OAT1的基因相对表达为0.60±0.04，与正常组细胞相比，其表达基因表达量显著下降，MCT12的沉默效率约为58％，OAT1的基因沉默效率约为40％，westernblot结果显示MCT12和OAT1的蛋白表达水平相比正常组显著降低。
3.高效液相检测MCT12沉默组HLECs对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.342±0.033μmol/g和0.444±0.031μmol/g;OAT1沉默组对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.609±0.023μmol/g和0.092±0.009μmol/g。正常HLECs对石斛酚和丁香酸的吸收量分别为0.570±0.008μmol/g和0.496±0.070μmol/g。与正常细胞对石斛酚的吸收量相比，MCT12沉默组HLECs对石斛酚的吸收量明显减少，而对丁香酸的吸收量无明显改变。与正常细胞对丁香酸的吸收量比较，OAT1沉默组对丁香酸的吸收量明显减少，而对石斛酚的吸收量无明显改变。
4.正常HLECs细胞的粘滞力大小为0.050±0.008nN，石斛酚作用之后细胞粘滞力增加，大小为0.329±0.022nN，与正常细胞粘滞力相比显著增加，当MCT12被沉默再给予石斛酚之后，粘滞力为0.123±0.015nN，与正常细胞+石斛酚组相比显著减少;当丁香酸作用之后细胞粘滞力大小为0.219±0.035nN，与正常组比较显著增加，当OAT1被沉默再给予丁香酸之后，细胞的粘滞力为0.103±0.007nN，与正常细胞+丁香酸组相比显著减少。
结论:
石斛酚在沉默MCT12的细胞吸收量显著减少，丁香酸在沉默OAT1的HLECs的吸收量显著减少，表明石斛酚和丁香酸分别经转运蛋白MCT12和OAT1转运吸收，转运过程中石斛酚与MCT12、丁香酸与OAT1的相互结合和作用力引起细胞粘滞力发生明显改变。