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目的:
细菌通过感知特定小化学分子实现细菌间通讯的过程称为群体感应(quorum sensing，QS)。细菌在环境中繁殖，密度不断增加，其分泌的小化学分子亦逐渐累积，在达到一定浓度时，这些小化学分子可作为群体感应信号与相应受体结合并激活受体，激活后的受体发挥转录调控作用，改变相关基因的表达，继而调控自身多项活动功能。大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)是环境中的常见菌，其自身包含多个类型的群体感应系统。不同的类型的群体感应系统主要是接收的信号分子不同[1]，其中以N-酰基-L-高丝氨酸内酯(acylatedhomoserinelactones，AHLs)的作用最为广泛，且研究最深入，此类型的QS系统由LuxI/LuxR双组分构成。LuxI同源基因编码AHLs合成酶，LuxR同源基因编码信号分子受体蛋白，后者被AHLs激活并发挥转录调控作用。有趣的是，大肠埃希菌缺乏LuxI同源基因，因而不能合成AHLs，但有LuxR同源基因可合成信号分子受体蛋白。抑制细胞分裂抑制子(suppressor of cell division inhibitor，SdiA)是目前大肠埃希菌唯一明确的QS受体蛋白，其可通过感应其他细菌分泌的AHLs，并发生应答，激活后的SdiA可调控自身相关基因的转录，以适应群体生活[2]。目前，多项研究表明大肠埃希菌QS受体蛋白SdiA可调控细菌生物发光[3]，毒力因子表达[4]，生物膜形成[5]，质粒DNA水平转移等[6]。
SdiA由发现至今只有二十年历史，其相关研究仍处于摸索阶段，目前其研究现状由于实验模型和实验条件的差异，研究结果常常不一致，甚至出现完全截然不同的研究结论[7]。再者SdiA作为转录调节子，调控的下游基因众多，但根据目前研究明确列出的基因却很少，基因间亦缺乏联系，导致SdiA的功能仍需进一步探索。因此本研究旨在探究大肠埃希菌中受群体感应系统受体蛋白SdiA表达调控的基因，继而发掘受SdiA调控的潜在基因，进一步完善SdiA的生物学功能，为后续阻断以QS系统为感染途径的抗感染手段作理论基础。
方法:
1、构建sdiA过表达回复株
用高保真Taq酶扩增E.coliSM10λpir野生株sdiA基因，再利用限制性内切酶BamHI、HindⅢ分别将sdiA基因纯化物和质粒pSTV28进行双酶切。二者再利用T4DNA连接酶进行连接，构建pSTV28-sdiA过表达质粒，最后将该质粒转化进入感受态E.coliSM10λpirsdiA敲除株中，获得E.coliSM10λpirsdiA过表达回复株。另外，将E.coliSM10λpir野生株、sdiA敲除株制成感受态细胞，将质粒pSTV28空载进入菌体，保持实验菌株质粒载量的一致性。通过提取构建菌株内的质粒进行PCR和DNA测序以确定sdiA基因的插入情况;其次，采用荧光定量PCR对菌株验证sdiA基因的表达情况。
2、SdiA对大肠埃希菌转录组基因表达的影响
利用RNA-seq测定E.coliSM10λpir野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株经过AHLs处理或不经AHLs处理后，菌株转录组基因表达的变化。原始数据经过滤后，利用软件Trinity分析差异表达基因，以log2FC绝对值大于1.5且差异P值(Pvalue)小于0.05作为差异基因筛选标准，对满足标准的基因进行可视化分析，并筛选出受SdiA潜在调控的基因。利用荧光定量PCR验证受SdiA潜在调控基因的表达情况。
3、SdiA对大肠埃希菌主动外排系统的影响
利用荧光定量PCR检测E.coliSM10λpir、E.coliBW25113的野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株主动外排基因acrA、acrR的表达情况。联合外排系统抑制剂PAβN检测上述菌株多种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。
4、SdiA对大肠埃希菌抗酸系统的影响
利用荧光定量PCR检测E.coliSM10λpir、E.coliBW25113的野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株抗酸基因gadW的表达情况。监测不同PH值培养环境中菌株的生长情况，并在极低PH环境(PH3、PH4)中进一步评估菌株的存活率。
结果:
1、E.coiiSM10λpirsdiA过表达回复株提取的质粒DNA测序峰图良好，通过NCBIBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析sdiA基因完整，qPCR验证菌株sdiA基因表达情况提示sdiA敲除株SdiA不表达、sdiA过表达回复株SdiA高表达。
2、E.coliSM10λpir的转录组可检测到4500个基因，其中在转录过程中出现变化的有2850个基因。在无AHLs处理情况下，sdiA敲除株与野生株比较有14个基因出现表达差异，其中上调表达基因8个，下调表达基因6个，而与sdiA过表达回复株比较则有109个基因出现差异性表达，其中上调表达基因65个，下调表达基因44个。在有AHLs处理情况下，sdiA敲除株与野生株比较有18个基因出现表达差异，其中上调表达基因13个，下调表达基因5个，而与sdiA过表达回复株比较则有91个差异表达基因，其中55个基因上调表达，36个基因下调表达。同一菌株在有AHLs处理和无AHLs处理情况下比较，野生株有3个基因表达上调，3个基因表达下调;sdiA敲除株有1个基因表达上调，4个基因表达下调;sdiA过表达回复株有3个基因表达上调，3个基因表达下调;
3、在无AHLs存在情况下，当SdiA高表达时，paaE、flu、yeeR基因表达上调，而narH、narJ、narI、yeeE基因表达下调。在有AHLs存在情况下，当SdiA高表达时，上述表达模式仍然存在(除paaE、yeeE)，同时ydiV、hdhA基因出现表达上调，hcp、hcr、ytfE、hmp基因表达下调。因此，SdiA可能潜在调控narH、narJ、narI、yeeE、paaE、flu、yeeR、hcp、hcr、ytfE、hmp、ydiV、hdhA基因的表达，其中hcp、hcr、ytfE、hmp、ydiV、hdhA基因的表达需依赖AHLs介导。
4、在E.coli中，SdiA的表达量对细菌多种抗生素MIC无影响，在SdiA表达差异菌株中，其MIC结果一致。相反，在外排泵抑制剂PaβN(50μg/ml)的作用下，与未加入时相比，E.coliSM10λpit对阿奇霉素的MIC由8μg/ml降至1μg/ml甚至0.5μg/ml，头孢他啶由0.125μg/ml降至0.0625μg/ml，而E.coliBW25113对头孢他啶的MIC由0.125μg/ml降至0.0625μg/ml，对庆大霉素MIC由8μg/ml降至4μg/ml，阿奇霉素和卡那霉素MIC由16μg/ml降至8μg/ml，提示E.coliSM10λpir和E.coliBW25113均存在RND型主动外排系统，但其外排泵的活跃与SdiA的表达量无直接关系。
5、在E.coli中，SdiA的表达量明显影响着细菌的抗酸作用，SdiA缺失可明显降低菌株的抗酸性，在弱酸性环境中外源性SdiA对细菌的抗酸性影响小于内源性SdiA;在极低PH环境中，内外源性SdiA均可增强细菌抗酸性，且作用程度一致。
结论:
1、成功构建E.coliSM10λpirsdiA过表达回复株。
2、群体感应系统信号分子AHLs对大肠埃希菌基因表达的影响小于群体感应系统受体蛋白SdiA，且外源性(质粒过表达)SdiA的对细菌基因表达的影响大于内源性(细菌自身基因)SdiA。
3、大肠埃希菌中SdiA可能通过调控基因natH、narJ、narI、hcp、hcr、hmp、ytfE的表达参与硝酸盐的代谢;通过调控ydiV基因调节鞭毛的合成;通过调控yeeE、yeeR、flu基因影响细菌生物膜的形成;通过调控基因paaE、hdhA参与环境化学物的代谢等，但相应的具体机制仍需进一步探究。
4、大肠埃希菌SdiA与主动外排系统相关基因的调控关系不明显。
5、大肠埃希菌SdiA通过调控GAD型抗酸基因，调控细菌的抗酸能力。
细菌通过感知特定小化学分子实现细菌间通讯的过程称为群体感应(quorum sensing，QS)。细菌在环境中繁殖，密度不断增加，其分泌的小化学分子亦逐渐累积，在达到一定浓度时，这些小化学分子可作为群体感应信号与相应受体结合并激活受体，激活后的受体发挥转录调控作用，改变相关基因的表达，继而调控自身多项活动功能。大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)是环境中的常见菌，其自身包含多个类型的群体感应系统。不同的类型的群体感应系统主要是接收的信号分子不同[1]，其中以N-酰基-L-高丝氨酸内酯(acylatedhomoserinelactones，AHLs)的作用最为广泛，且研究最深入，此类型的QS系统由LuxI/LuxR双组分构成。LuxI同源基因编码AHLs合成酶，LuxR同源基因编码信号分子受体蛋白，后者被AHLs激活并发挥转录调控作用。有趣的是，大肠埃希菌缺乏LuxI同源基因，因而不能合成AHLs，但有LuxR同源基因可合成信号分子受体蛋白。抑制细胞分裂抑制子(suppressor of cell division inhibitor，SdiA)是目前大肠埃希菌唯一明确的QS受体蛋白，其可通过感应其他细菌分泌的AHLs，并发生应答，激活后的SdiA可调控自身相关基因的转录，以适应群体生活[2]。目前，多项研究表明大肠埃希菌QS受体蛋白SdiA可调控细菌生物发光[3]，毒力因子表达[4]，生物膜形成[5]，质粒DNA水平转移等[6]。
SdiA由发现至今只有二十年历史，其相关研究仍处于摸索阶段，目前其研究现状由于实验模型和实验条件的差异，研究结果常常不一致，甚至出现完全截然不同的研究结论[7]。再者SdiA作为转录调节子，调控的下游基因众多，但根据目前研究明确列出的基因却很少，基因间亦缺乏联系，导致SdiA的功能仍需进一步探索。因此本研究旨在探究大肠埃希菌中受群体感应系统受体蛋白SdiA表达调控的基因，继而发掘受SdiA调控的潜在基因，进一步完善SdiA的生物学功能，为后续阻断以QS系统为感染途径的抗感染手段作理论基础。
方法:
1、构建sdiA过表达回复株
用高保真Taq酶扩增E.coliSM10λpir野生株sdiA基因，再利用限制性内切酶BamHI、HindⅢ分别将sdiA基因纯化物和质粒pSTV28进行双酶切。二者再利用T4DNA连接酶进行连接，构建pSTV28-sdiA过表达质粒，最后将该质粒转化进入感受态E.coliSM10λpirsdiA敲除株中，获得E.coliSM10λpirsdiA过表达回复株。另外，将E.coliSM10λpir野生株、sdiA敲除株制成感受态细胞，将质粒pSTV28空载进入菌体，保持实验菌株质粒载量的一致性。通过提取构建菌株内的质粒进行PCR和DNA测序以确定sdiA基因的插入情况;其次，采用荧光定量PCR对菌株验证sdiA基因的表达情况。
2、SdiA对大肠埃希菌转录组基因表达的影响
利用RNA-seq测定E.coliSM10λpir野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株经过AHLs处理或不经AHLs处理后，菌株转录组基因表达的变化。原始数据经过滤后，利用软件Trinity分析差异表达基因，以log2FC绝对值大于1.5且差异P值(Pvalue)小于0.05作为差异基因筛选标准，对满足标准的基因进行可视化分析，并筛选出受SdiA潜在调控的基因。利用荧光定量PCR验证受SdiA潜在调控基因的表达情况。
3、SdiA对大肠埃希菌主动外排系统的影响
利用荧光定量PCR检测E.coliSM10λpir、E.coliBW25113的野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株主动外排基因acrA、acrR的表达情况。联合外排系统抑制剂PAβN检测上述菌株多种抗生素的最低抑菌浓度(MIC)。
4、SdiA对大肠埃希菌抗酸系统的影响
利用荧光定量PCR检测E.coliSM10λpir、E.coliBW25113的野生株、sdiA敲除株和sdiA过表达回复株抗酸基因gadW的表达情况。监测不同PH值培养环境中菌株的生长情况，并在极低PH环境(PH3、PH4)中进一步评估菌株的存活率。
结果:
1、E.coiiSM10λpirsdiA过表达回复株提取的质粒DNA测序峰图良好，通过NCBIBLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析sdiA基因完整，qPCR验证菌株sdiA基因表达情况提示sdiA敲除株SdiA不表达、sdiA过表达回复株SdiA高表达。
2、E.coliSM10λpir的转录组可检测到4500个基因，其中在转录过程中出现变化的有2850个基因。在无AHLs处理情况下，sdiA敲除株与野生株比较有14个基因出现表达差异，其中上调表达基因8个，下调表达基因6个，而与sdiA过表达回复株比较则有109个基因出现差异性表达，其中上调表达基因65个，下调表达基因44个。在有AHLs处理情况下，sdiA敲除株与野生株比较有18个基因出现表达差异，其中上调表达基因13个，下调表达基因5个，而与sdiA过表达回复株比较则有91个差异表达基因，其中55个基因上调表达，36个基因下调表达。同一菌株在有AHLs处理和无AHLs处理情况下比较，野生株有3个基因表达上调，3个基因表达下调;sdiA敲除株有1个基因表达上调，4个基因表达下调;sdiA过表达回复株有3个基因表达上调，3个基因表达下调;
3、在无AHLs存在情况下，当SdiA高表达时，paaE、flu、yeeR基因表达上调，而narH、narJ、narI、yeeE基因表达下调。在有AHLs存在情况下，当SdiA高表达时，上述表达模式仍然存在(除paaE、yeeE)，同时ydiV、hdhA基因出现表达上调，hcp、hcr、ytfE、hmp基因表达下调。因此，SdiA可能潜在调控narH、narJ、narI、yeeE、paaE、flu、yeeR、hcp、hcr、ytfE、hmp、ydiV、hdhA基因的表达，其中hcp、hcr、ytfE、hmp、ydiV、hdhA基因的表达需依赖AHLs介导。
4、在E.coli中，SdiA的表达量对细菌多种抗生素MIC无影响，在SdiA表达差异菌株中，其MIC结果一致。相反，在外排泵抑制剂PaβN(50μg/ml)的作用下，与未加入时相比，E.coliSM10λpit对阿奇霉素的MIC由8μg/ml降至1μg/ml甚至0.5μg/ml，头孢他啶由0.125μg/ml降至0.0625μg/ml，而E.coliBW25113对头孢他啶的MIC由0.125μg/ml降至0.0625μg/ml，对庆大霉素MIC由8μg/ml降至4μg/ml，阿奇霉素和卡那霉素MIC由16μg/ml降至8μg/ml，提示E.coliSM10λpir和E.coliBW25113均存在RND型主动外排系统，但其外排泵的活跃与SdiA的表达量无直接关系。
5、在E.coli中，SdiA的表达量明显影响着细菌的抗酸作用，SdiA缺失可明显降低菌株的抗酸性，在弱酸性环境中外源性SdiA对细菌的抗酸性影响小于内源性SdiA;在极低PH环境中，内外源性SdiA均可增强细菌抗酸性，且作用程度一致。
结论:
1、成功构建E.coliSM10λpirsdiA过表达回复株。
2、群体感应系统信号分子AHLs对大肠埃希菌基因表达的影响小于群体感应系统受体蛋白SdiA，且外源性(质粒过表达)SdiA的对细菌基因表达的影响大于内源性(细菌自身基因)SdiA。
3、大肠埃希菌中SdiA可能通过调控基因natH、narJ、narI、hcp、hcr、hmp、ytfE的表达参与硝酸盐的代谢;通过调控ydiV基因调节鞭毛的合成;通过调控yeeE、yeeR、flu基因影响细菌生物膜的形成;通过调控基因paaE、hdhA参与环境化学物的代谢等，但相应的具体机制仍需进一步探究。
4、大肠埃希菌SdiA与主动外排系统相关基因的调控关系不明显。
5、大肠埃希菌SdiA通过调控GAD型抗酸基因，调控细菌的抗酸能力。