论文部分内容阅读
[目的]
从整体和分子水平探讨中药筋脉通(Jinmaitong，JMT)对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病(diabetes mellitus，DM)模型大鼠的髓鞘保护作用及对其肠道菌群的影响，探索中药筋脉通防治糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的潜在机制。
[方法]
采用一次性腹腔注射STZ55mg/kg的方法制备DM模型大鼠，将造模成功后的DM大鼠按随机数字表法分为三组:糖尿病模型对照组(DM)，筋脉通组(JMT)，神经妥乐平(Neurotropin，NTP)组(NTP)，同时配以同周龄的正常对照组(CON)大鼠。分组后分别按JMT13.9g/(kg·d)、NTP1.6单位/(kg·d)灌胃给药，CON组与DM组大鼠予以等量蒸馏水灌胃，每日1次，连续12w。分别于干预前及干预后4w、8w、12w检测各组大鼠随机血糖和体重。灌胃12w后检测各组大鼠机械痛阈值，并收集大鼠粪便样品，腹主动脉采血后取大鼠坐骨神经组织与足底皮肤组织。光学显微镜及透射电子显微镜下观察坐骨神经的形态变化，免疫荧光法检测大鼠坐骨神经中接触蛋白相关蛋白(contactin-associated protein，Caspr)与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的表达，分析大鼠足底皮肤表皮神经纤维密度(intraepidermal nerve fiber density，IENFD)，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测大鼠血清神经调节蛋白1(Neuregulin1，NRG1)浓度。同时，提取大鼠粪便基因组并进行16SrRNA基因测序，分析正常组与模型组大鼠肠道菌群组成结构的差异，以及筋脉通干预对模型组大鼠肠道菌群的影响;并将组间差异性肠道微生物的丰度与大鼠随机血糖、体重、机械痛阈值、IENFD、NRG1水平等生理、病理观察指标进行相关性分析。
[结果]
1.血糖、体重及机械痛阈检测:
造模后不同时间点，各造模组大鼠随机血糖均较CON组升高(P＜0.05);同一时间点各造模组大鼠之间的血糖无统计学差异(P＞0.05)。干预前各组大鼠体重均无统计学差异(P＞0.05);干预后各时间点，各造模组大鼠体重较CON组均明显降低(P＜0.001)。除灌胃第8wNTP组较DM组体重增加外(P＜0.05)，其余时间点各造模组大鼠之间的体重无显著差异(P＞0.05)。与CON组相比，除JMT组左侧机械痛阈值外，各造模组大鼠左、右两侧机械痛阈值及平均机械痛阈值较CON组均降低(P＜0.01);与DM组相比，JMT组及NTP组左、右两侧机械痛阈及平均机械痛阈值均显著提高(P＜0.001);JMT组与NTP组相比未见统计学差异(P＞0.05)。
2.坐骨神经病理结构变化:
HE染色显示，大鼠坐骨神经组织轴索与髓鞘呈深红色，雪旺细胞细胞核位于髓鞘边缘呈蓝紫色。CON组大鼠坐骨神经组织致密，轮廓规则，髓鞘完整，分布均匀，DM组大鼠坐骨神经组织松散，轮廓不规则，部分神经纤维髓鞘脱失，轴索萎缩，分布稀疏;透射电镜下可见CON组大鼠坐骨神经轴索饱满、均匀，形态规则，髓鞘致密、均一，结构完整，局部可见髓鞘板层轻微断裂;DM组大鼠坐骨神经轴索形态不规则，髓鞘结构紊乱，板层分离形成大量空泡，部分可见髓鞘向轴索及间质突出，形成“瘤状”结构。形态测量学统计分析显示，DM组大鼠每5000μm2面积内的有髓神经纤维数量明显减少(P＜0.001)，结构形态异常的神经纤维比例增高(P＜0.05);JMT组与NTP组大鼠坐骨神经病变与DM组相似，但程度均较DM组减轻，每5000μm2面积内的有髓神经纤维数量增加(P＜0.05)，结构形态异常的神经纤维比例明显减少(P＜0.001);各组大鼠的gratio值(轴索直径与髓鞘外径比值)无统计学差异(P＞0.05)。
3.免疫荧光法检测大鼠坐骨神经接触蛋白相关蛋白Caspr与淀粉样前体蛋白APP的表达:
与CON组相比，DM组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量与比例均降低(P＜0.01)、非对称性的郎飞氏结半结比例增高(P＜0.01)，DM组与NTP组大鼠坐骨神经中APP与βⅢ-tubulin蛋白共定位表达的区域比例升高(P＜0.05);与DM组相比，JMT组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量与比例均升高(P＜0.05)、非对称性的郎飞氏结半结比例降低(P＜0.01)，JMT组大鼠坐骨神中APP与βⅢ-tubulin蛋白共定位表达的区域比例降低(P＜0.05);与NTP组相比，JMT组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量增多(P＜0.05)，其余指标二者无统计学差异(P＞0.05)。各组间非对称性的郎飞氏结半结数量均未见统计学差异(P＞0.05)。
4.免疫荧光法检测分析大鼠足底皮肤表皮神经纤维密度IENFD:
与CON组相比，DM组与NTP组IENFD降低(P＜0.05)，JMT组IENFD与CON组相比无统计学差异(P＞0.05);与DM组相比，JMT组IENFD升高(P＜0.05)，NTP组与DM组相比无统计学差异(P＞0.05);JMT组与NTP组之间IENFD无统计学差异(P＞0.05)。
5.ELISA法检测大鼠血清NRG1的表达:
与CON组相比，DM组、JMT组及NTP组大鼠血清NRG1浓度均降低(P＜0.001);与DM组相比，JMT组大鼠血清NRG1浓度升高(P＜0.01)，NTP组与DM组相比差异无统计学意义(P＞0.05);JMT组与NTP组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。
6.16SrRNA基因测序分析大鼠的肠道菌群结构变化:
基于以上实验结果可判定DPN模型成功，就此更名DM组为DPN组。相比CON组，DPN组和JMT组大鼠肠道菌群的Alpha多样性指数明显降低(P＜0.001)，DPN组与JMT组之间的Alpha多样性指数无统计学差异(P＞0.05)。Beta多样性的Weighted-UniFrac与Unweighted-UniFrac分析结果均提示，CON、DPN、JMT三组大鼠肠道菌群的Beta多样性具有显著性差异(P＜0.01)。相比CON组大鼠，DPN组大鼠的肠道菌群中显著富集了以下10种差异性肠道微生物:p_Bacteroidetes，c_Bacteroidia,o_Bacteroidales,f_Porphyromonadaceae,f_Prevotellaceae,f_Oxalobacteraceae,g_Klebsiella,g_Coprococcus,g_Prevotella,g_Oxalobacter。相比DPN组，JMT组大鼠的肠道菌群中显著富集了17种差异性肠道微生物，且其中有9种与CON组一致:p_Actinobacteria，p_Proteobacteria，c_Betaproteobacteria，c_Actinobacteria,c_Epsilonproteobacteria,o_Burkholderiales,o_Campylobacterales,f_Helicobacteraceae，g_Helicobacter，说明筋脉通对上述9种肠道微生物的丰度具有回调作用。
7.差异性肠道微生物丰度与DPN观察指标的Spearman相关性分析:
在DPN组与CON组对比时富集到的10种差异性肠道微生物中，所有肠道微生物丰度均与大鼠第12w随机血糖水平呈正相关(|r|＞0.45，P＜0.05)，并且与大鼠第12w体重呈负相关(|r|＞0.45，P＜0.05);除f_Prevotellaceae与大鼠血清NRG1水平无相关性外(|r|＜0.40，P＞0.05)，其余9种的微生物丰度还同时与大鼠血清NRG1水平呈负相关(|r|＞0.45，P＜0.05)。在DPN组显著富集的10种差异性肠道微生物中，f_Porphyromonadaceae和g_Prevotella的丰度同时与大鼠的机械痛阈值和IENFD呈负相关(|r|＞0.40，P＜0.05)。筋脉通可显著回调的9种肠道微生物的丰度均与大鼠血清NRG1水平呈正相关(|r|＞0.40，P＜0.05)。除c_Betaproteobacteria和oBurkholderiales外，其余7种肠道微生物的丰度均与大鼠机械痛阈值(|r|＞0.5，P＜0.05)和IENFD(|r|＞0.45，P＜0.05)呈正相关。其中，p_Actinobacteria，p_Proteobacteria和c_Actinobacteria的丰度同时与大鼠第12w体重呈正相关(|r|＞0.5，P＜0.01)，与大鼠第12w随机血糖水平呈负相关(|r|＞0.55，P＜0.01)。
[结论]
1.DM大鼠12w后出现痛觉过敏，坐骨神经病理形态学改变，及足底皮肤IENFD降低，表明DPN模型建立成功;DM大鼠血清NRG1分泌减少，坐骨神经Caspr表达抑制，APP表达增强，符合典型的糖尿病周围神经病变的病理特征。
2.筋脉通可通过升高DM大鼠血清NRG1水平，促进坐骨神经Caspr表达，抑制APP表达，增加足底皮肤IENFD，改善其痛觉过敏及坐骨神经病理形态异常，发挥其髓鞘保护作用。
3.筋脉通在维持坐骨神经正常结构形态与对称性的郎飞氏结结侧区数量上优于阳性对照药物NTP。
4.DPN组大鼠的肠道菌群结构较CON组发生了明显变化，肠道菌群的物种丰富度、多样性与均匀性显著降低，可能通过富集f_Porphyromonadaceae和g_Prevotella影响DPN的各观察指标。
5.筋脉通改变了DPN大鼠肠道微生物群落的整体组成，回调了9种在CON组显著富集的差异性肠道微生物，并可能通过富集p_Actinobacteria、p_Proteobacteria和c_Actinobacteria参与发挥髓鞘保护作用。
[创新点]
通过整体动物实验，从分子水平研究了中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经组织中接触蛋白相关蛋白Caspr、淀粉样前体蛋白APP，以及血清神经调节蛋白1表达的影响，并尝试从肠道菌群的角度解释中药筋脉通防治DPN与发挥髓鞘保护作用的潜在机制，为中药筋脉通治疗DPN的临床应用提供了新的实验依据。
从整体和分子水平探讨中药筋脉通(Jinmaitong，JMT)对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病(diabetes mellitus，DM)模型大鼠的髓鞘保护作用及对其肠道菌群的影响，探索中药筋脉通防治糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)的潜在机制。
[方法]
采用一次性腹腔注射STZ55mg/kg的方法制备DM模型大鼠，将造模成功后的DM大鼠按随机数字表法分为三组:糖尿病模型对照组(DM)，筋脉通组(JMT)，神经妥乐平(Neurotropin，NTP)组(NTP)，同时配以同周龄的正常对照组(CON)大鼠。分组后分别按JMT13.9g/(kg·d)、NTP1.6单位/(kg·d)灌胃给药，CON组与DM组大鼠予以等量蒸馏水灌胃，每日1次，连续12w。分别于干预前及干预后4w、8w、12w检测各组大鼠随机血糖和体重。灌胃12w后检测各组大鼠机械痛阈值，并收集大鼠粪便样品，腹主动脉采血后取大鼠坐骨神经组织与足底皮肤组织。光学显微镜及透射电子显微镜下观察坐骨神经的形态变化，免疫荧光法检测大鼠坐骨神经中接触蛋白相关蛋白(contactin-associated protein，Caspr)与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)的表达，分析大鼠足底皮肤表皮神经纤维密度(intraepidermal nerve fiber density，IENFD)，酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测大鼠血清神经调节蛋白1(Neuregulin1，NRG1)浓度。同时，提取大鼠粪便基因组并进行16SrRNA基因测序，分析正常组与模型组大鼠肠道菌群组成结构的差异，以及筋脉通干预对模型组大鼠肠道菌群的影响;并将组间差异性肠道微生物的丰度与大鼠随机血糖、体重、机械痛阈值、IENFD、NRG1水平等生理、病理观察指标进行相关性分析。
[结果]
1.血糖、体重及机械痛阈检测:
造模后不同时间点，各造模组大鼠随机血糖均较CON组升高(P＜0.05);同一时间点各造模组大鼠之间的血糖无统计学差异(P＞0.05)。干预前各组大鼠体重均无统计学差异(P＞0.05);干预后各时间点，各造模组大鼠体重较CON组均明显降低(P＜0.001)。除灌胃第8wNTP组较DM组体重增加外(P＜0.05)，其余时间点各造模组大鼠之间的体重无显著差异(P＞0.05)。与CON组相比，除JMT组左侧机械痛阈值外，各造模组大鼠左、右两侧机械痛阈值及平均机械痛阈值较CON组均降低(P＜0.01);与DM组相比，JMT组及NTP组左、右两侧机械痛阈及平均机械痛阈值均显著提高(P＜0.001);JMT组与NTP组相比未见统计学差异(P＞0.05)。
2.坐骨神经病理结构变化:
HE染色显示，大鼠坐骨神经组织轴索与髓鞘呈深红色，雪旺细胞细胞核位于髓鞘边缘呈蓝紫色。CON组大鼠坐骨神经组织致密，轮廓规则，髓鞘完整，分布均匀，DM组大鼠坐骨神经组织松散，轮廓不规则，部分神经纤维髓鞘脱失，轴索萎缩，分布稀疏;透射电镜下可见CON组大鼠坐骨神经轴索饱满、均匀，形态规则，髓鞘致密、均一，结构完整，局部可见髓鞘板层轻微断裂;DM组大鼠坐骨神经轴索形态不规则，髓鞘结构紊乱，板层分离形成大量空泡，部分可见髓鞘向轴索及间质突出，形成“瘤状”结构。形态测量学统计分析显示，DM组大鼠每5000μm2面积内的有髓神经纤维数量明显减少(P＜0.001)，结构形态异常的神经纤维比例增高(P＜0.05);JMT组与NTP组大鼠坐骨神经病变与DM组相似，但程度均较DM组减轻，每5000μm2面积内的有髓神经纤维数量增加(P＜0.05)，结构形态异常的神经纤维比例明显减少(P＜0.001);各组大鼠的gratio值(轴索直径与髓鞘外径比值)无统计学差异(P＞0.05)。
3.免疫荧光法检测大鼠坐骨神经接触蛋白相关蛋白Caspr与淀粉样前体蛋白APP的表达:
与CON组相比，DM组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量与比例均降低(P＜0.01)、非对称性的郎飞氏结半结比例增高(P＜0.01)，DM组与NTP组大鼠坐骨神经中APP与βⅢ-tubulin蛋白共定位表达的区域比例升高(P＜0.05);与DM组相比，JMT组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量与比例均升高(P＜0.05)、非对称性的郎飞氏结半结比例降低(P＜0.01)，JMT组大鼠坐骨神中APP与βⅢ-tubulin蛋白共定位表达的区域比例降低(P＜0.05);与NTP组相比，JMT组大鼠坐骨神经每mm2面积内对称性的郎飞氏结结侧区数量增多(P＜0.05)，其余指标二者无统计学差异(P＞0.05)。各组间非对称性的郎飞氏结半结数量均未见统计学差异(P＞0.05)。
4.免疫荧光法检测分析大鼠足底皮肤表皮神经纤维密度IENFD:
与CON组相比，DM组与NTP组IENFD降低(P＜0.05)，JMT组IENFD与CON组相比无统计学差异(P＞0.05);与DM组相比，JMT组IENFD升高(P＜0.05)，NTP组与DM组相比无统计学差异(P＞0.05);JMT组与NTP组之间IENFD无统计学差异(P＞0.05)。
5.ELISA法检测大鼠血清NRG1的表达:
与CON组相比，DM组、JMT组及NTP组大鼠血清NRG1浓度均降低(P＜0.001);与DM组相比，JMT组大鼠血清NRG1浓度升高(P＜0.01)，NTP组与DM组相比差异无统计学意义(P＞0.05);JMT组与NTP组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。
6.16SrRNA基因测序分析大鼠的肠道菌群结构变化:
基于以上实验结果可判定DPN模型成功，就此更名DM组为DPN组。相比CON组，DPN组和JMT组大鼠肠道菌群的Alpha多样性指数明显降低(P＜0.001)，DPN组与JMT组之间的Alpha多样性指数无统计学差异(P＞0.05)。Beta多样性的Weighted-UniFrac与Unweighted-UniFrac分析结果均提示，CON、DPN、JMT三组大鼠肠道菌群的Beta多样性具有显著性差异(P＜0.01)。相比CON组大鼠，DPN组大鼠的肠道菌群中显著富集了以下10种差异性肠道微生物:p_Bacteroidetes，c_Bacteroidia,o_Bacteroidales,f_Porphyromonadaceae,f_Prevotellaceae,f_Oxalobacteraceae,g_Klebsiella,g_Coprococcus,g_Prevotella,g_Oxalobacter。相比DPN组，JMT组大鼠的肠道菌群中显著富集了17种差异性肠道微生物，且其中有9种与CON组一致:p_Actinobacteria，p_Proteobacteria，c_Betaproteobacteria，c_Actinobacteria,c_Epsilonproteobacteria,o_Burkholderiales,o_Campylobacterales,f_Helicobacteraceae，g_Helicobacter，说明筋脉通对上述9种肠道微生物的丰度具有回调作用。
7.差异性肠道微生物丰度与DPN观察指标的Spearman相关性分析:
在DPN组与CON组对比时富集到的10种差异性肠道微生物中，所有肠道微生物丰度均与大鼠第12w随机血糖水平呈正相关(|r|＞0.45，P＜0.05)，并且与大鼠第12w体重呈负相关(|r|＞0.45，P＜0.05);除f_Prevotellaceae与大鼠血清NRG1水平无相关性外(|r|＜0.40，P＞0.05)，其余9种的微生物丰度还同时与大鼠血清NRG1水平呈负相关(|r|＞0.45，P＜0.05)。在DPN组显著富集的10种差异性肠道微生物中，f_Porphyromonadaceae和g_Prevotella的丰度同时与大鼠的机械痛阈值和IENFD呈负相关(|r|＞0.40，P＜0.05)。筋脉通可显著回调的9种肠道微生物的丰度均与大鼠血清NRG1水平呈正相关(|r|＞0.40，P＜0.05)。除c_Betaproteobacteria和oBurkholderiales外，其余7种肠道微生物的丰度均与大鼠机械痛阈值(|r|＞0.5，P＜0.05)和IENFD(|r|＞0.45，P＜0.05)呈正相关。其中，p_Actinobacteria，p_Proteobacteria和c_Actinobacteria的丰度同时与大鼠第12w体重呈正相关(|r|＞0.5，P＜0.01)，与大鼠第12w随机血糖水平呈负相关(|r|＞0.55，P＜0.01)。
[结论]
1.DM大鼠12w后出现痛觉过敏，坐骨神经病理形态学改变，及足底皮肤IENFD降低，表明DPN模型建立成功;DM大鼠血清NRG1分泌减少，坐骨神经Caspr表达抑制，APP表达增强，符合典型的糖尿病周围神经病变的病理特征。
2.筋脉通可通过升高DM大鼠血清NRG1水平，促进坐骨神经Caspr表达，抑制APP表达，增加足底皮肤IENFD，改善其痛觉过敏及坐骨神经病理形态异常，发挥其髓鞘保护作用。
3.筋脉通在维持坐骨神经正常结构形态与对称性的郎飞氏结结侧区数量上优于阳性对照药物NTP。
4.DPN组大鼠的肠道菌群结构较CON组发生了明显变化，肠道菌群的物种丰富度、多样性与均匀性显著降低，可能通过富集f_Porphyromonadaceae和g_Prevotella影响DPN的各观察指标。
5.筋脉通改变了DPN大鼠肠道微生物群落的整体组成，回调了9种在CON组显著富集的差异性肠道微生物，并可能通过富集p_Actinobacteria、p_Proteobacteria和c_Actinobacteria参与发挥髓鞘保护作用。
[创新点]
通过整体动物实验，从分子水平研究了中药筋脉通对糖尿病大鼠坐骨神经组织中接触蛋白相关蛋白Caspr、淀粉样前体蛋白APP，以及血清神经调节蛋白1表达的影响，并尝试从肠道菌群的角度解释中药筋脉通防治DPN与发挥髓鞘保护作用的潜在机制，为中药筋脉通治疗DPN的临床应用提供了新的实验依据。