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双受精是被子植物发育的标志性事件，在双子叶植物的双受精过程中一个精细胞与卵细胞融合形成合子，经过一系列的细胞分裂与分化发育为胚胎直至形成种子；另一个精子与中央细胞融合形成胚乳，其间经历了合胞体和细胞化阶段，它为胚胎发育提供营养，直至发育晚期降解并消失。早期胚胎发生形成了植物基本组织的前体，在过去数十年中，科学家们对拟南芥胚胎发育的机制进行了深入研究，发现其胚胎发生和模式建成的过程是高度程序化的，这些事件被一个精确而复杂的基因表达网络所调控，一系列基因参与了拟南芥胚胎发育和模式建成的过程。线粒体外膜转运酶(Translocase of the Outer Membrane，TOM)将细胞质中合成的蛋白前体转运进入线粒体中，起到门户通道的作用。前人对不同物种中TOM40蛋白的生物学功能进行了研究，结果表明该蛋白在酵母中的表达水平与氧离子的释放相关，在人类细胞中TOM40还被证实与衰老和疾病相关。然而在模式植物拟南芥中，关于TOM40的生物学功能仍然知之甚少。因此，本研究以拟南芥tom40的两个突变体为材料，利用生物信息学、分子生物学、细胞生物学、遗传学等技术手段，研究发现AtTOM40基因的突变引起线粒体结构紊乱，导致胚胎发育异常，最终引起种子败育。同时，还利用酵母双杂交技术对拟南芥TOM复合体各亚基之间的相互作用关系进行了研究，为阐明TOM40在拟南芥中的作用机制提供了实验依据和新的信息，具有重要的理论意义。本研究获得的主要结果如下：
1、首先利用生物信息学软件CLUSTALX(版本1.83)、MEGA4、Swiss-PdbViewer4.01和PyMOL1.7，以及在线数据库http://www.arabidopsis.org、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov、http://swissmodel.expasy.org/、http://swissmodel.expasy.org、https://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch和http://ibs.biocuckoo.org，从氨基酸序列、进化关系分析、三维模建、结构域预测等、方面对不同物种的TOM40蛋白进行了生物信息学分析，发现TOM40蛋白在不同真核生物中的氨基酸结构和序列比较保守，AtTOM40蛋白含有19个β-链片段结构域和2个α-螺旋结构，与油菜的同源性最高。以酵母TOM40为模板对双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中TOM40的三维结构进行同源建模，三个物种中的TOM40蛋白主体结构基本重合，均含有19个β-链片段结构域的桶状蛋白，其中拟南芥和水稻的蛋白结构中含有2个α-螺旋结构。进一步对不同物种的TOM40蛋白进行结构预测，结果显示TOM40是一类真核生物中的孔状蛋白，在不同物种中该蛋白均存在一个孔状结构域，其大小从308个(拟南芥)氨基酸至387个(酵母)氨基酸不等，推测这个保守的孔状结构域的功能在于协助未折叠的多肽链运输进入线粒体。上述结果表明TOM40是一类较为保守的蛋白，在生物体中行使着基本的生物学功能。
2、从拟南芥突变体库ABRC(Arabidopsis biological resource center )((http://abrc.osu.edu/)中购买了TOM40的两个T-DNA插入突变体SALK_128170(tom40-1/+)和CS873594(tom40-2/+)，并对其进行了鉴定和分析。利用三引物法对上述两个突变体的T-DNA侧翼序列进行鉴定，发现tom40-1突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第二个外显子上，tom40-2突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第七个外显子上。随后对两个突变体进行筛选和鉴定，发现其均为杂合突变体，无法获得纯合后代，同时两个突变体的雌、雄配子体发育不受影响，但在成熟角果中会出现异常的白化种子并最终死亡，两个突变体中的种子败育率分别为24.92%和25.04%，表明AtTOM40基因的突变导致胚胎隐性纯合致死。回复实验证实两个突变体的胚胎致死表型均可以被完全回复，表明AtTOM40基因的突变是造成败育的直接原因。
3、对两个突变体进行胚珠透明观察发现，从心形期胚胎开始两个突变体中的胚胎发育出现异常，不能分化出正常的子叶和顶端分生组织等器官原基，类似球形时期的胚胎。对两个突变体中胚体的高度和宽度进行测量，结果表明胚体的体积会随着发育的进程而增大，但最终会发育停滞。对野生型和两个突变体的胚胎发育进程进行统计，结果表明随着发育的进程，两个突变体中类似球形胚的占比越来越高，其最终比例分别为24.39%和24.49%，与败育率相当。对tom40-1突变体中胚乳观察的结果表明，胚乳可以正常游离核分裂和细胞化。以上结果证实AtTOM40基因的突变会引起胚胎发育异常并最终败育，AtTOM40基因在拟南芥胚胎发育过程中起着重要作用。
4、利用荧光实时定量PCR技术对AtTOM40基因的转录水平表达进行了检测，结果表明该基因在根、茎、叶、花、花序、授粉后1/3/5/7天的角果以及萌发后7天和14天的幼苗中都有表达，其中在成熟的花、花序和授粉后1天的角果中表达量较高。将AtTOM40启动子与GUS蛋白融合表达并检测GUS信号，结果显示在成熟叶片、毛状体、萌发7天的幼苗和花序中GUS信号较强，尤其是在成熟胚胎的子叶中表达强烈，但在花药、花丝、柱头等生殖器官中的GUS信号则较弱，甚至检测不到，推测AtTOM40基因参与了拟南芥营养生长和胚胎发育及器官原基分化，但不参与雌雄配子体的发育。进一步利用原位杂交技术研究了AtTOM40基因转录本在拟南芥胚胎中的表达模式，结果在不同时期的胚胎、胚乳游离核以及子叶中均检测到该基因的表达，表明AtTOM40基因参与了拟南芥胚胎和胚乳的发育过程。
5、将AtTOM40启动子与GFP蛋白进行融合表达，同时对叶肉原生质体用MitotrackerRed染色。利用激光共聚焦扫描显微镜观察转基因植株叶肉原生质体中GFP荧光定位与Mitotracker染色，结果表明叶肉原生质体中的AtTOM40蛋白与线粒体荧光存在共定位现象，显示该蛋白为线粒体蛋白。利用超薄切片和透射电镜观察的技术对线粒体超微结构进行观察，结果发现tom40-1突变体胚胎细胞中的线粒体嵴结构无法正常形成。上述结果证实了AtTOM40基因在拟南芥中定位于线粒体，该基因编码的是一个线粒体蛋白，与生物信息学的预测结果相符。同时，该基因的突变会影响胚胎细胞的线粒体结构，表明该基因参与了线粒体的生物发生，从而影响拟南芥的胚胎发育。
6、为了进一步研究AtTOM40基因的生物学功能，本研究还利用荧光实时定量PCR技术，以授粉后6天(DAP，Day after pollination)野生型种子和tom40-1突变体中白化种子为材料，对19个拟南芥线粒体外膜蛋白相关基因的表达情况进行了检测。结果发现14个基因表达发生了显著变化，证明AtTOM40基因的突变在转录水平上影响了线粒体外膜的功能，从而影响了线粒体的生物发生。对19个拟南芥胚胎发育和模式建成相关基因的表达水平也进行了检测，结果发现18个基因的表达均发生了显著变化，表明AtTOM40基因的突变导致胚胎发育和模式建成在转录水平发生变化。根据上述结果可以推测，AtTOM40基因的突变通过影响线粒体外膜功能从而影响拟南芥胚胎细胞的正常发育。
7.利用酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid)检测了拟南芥TOM40亚基与TOM复合体其他亚基之间的互作关系，结果发现TOM40能与TOM5和TOM9存在相互作用，TOM5与TOM7-1、TOM7-2、TOM9和TOM40都存在相互作用；TOM6与TOM7-1存在相互作用；TOM7-1与TOM7-2存在相互作用；TOM9与TOM7-1和TOM40存在相互作用。根据此实验结果绘制了拟南芥TOM复合体各亚基之间的互作关系示意图，为揭示TOM复合体在线粒体外膜蛋白转运过程中的作用机制提供信息。
1、首先利用生物信息学软件CLUSTALX(版本1.83)、MEGA4、Swiss-PdbViewer4.01和PyMOL1.7，以及在线数据库http://www.arabidopsis.org、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov、http://swissmodel.expasy.org/、http://swissmodel.expasy.org、https://www.ebi.ac.uk/interpro/sequencesearch和http://ibs.biocuckoo.org，从氨基酸序列、进化关系分析、三维模建、结构域预测等、方面对不同物种的TOM40蛋白进行了生物信息学分析，发现TOM40蛋白在不同真核生物中的氨基酸结构和序列比较保守，AtTOM40蛋白含有19个β-链片段结构域和2个α-螺旋结构，与油菜的同源性最高。以酵母TOM40为模板对双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中TOM40的三维结构进行同源建模，三个物种中的TOM40蛋白主体结构基本重合，均含有19个β-链片段结构域的桶状蛋白，其中拟南芥和水稻的蛋白结构中含有2个α-螺旋结构。进一步对不同物种的TOM40蛋白进行结构预测，结果显示TOM40是一类真核生物中的孔状蛋白，在不同物种中该蛋白均存在一个孔状结构域，其大小从308个(拟南芥)氨基酸至387个(酵母)氨基酸不等，推测这个保守的孔状结构域的功能在于协助未折叠的多肽链运输进入线粒体。上述结果表明TOM40是一类较为保守的蛋白，在生物体中行使着基本的生物学功能。
2、从拟南芥突变体库ABRC(Arabidopsis biological resource center )((http://abrc.osu.edu/)中购买了TOM40的两个T-DNA插入突变体SALK_128170(tom40-1/+)和CS873594(tom40-2/+)，并对其进行了鉴定和分析。利用三引物法对上述两个突变体的T-DNA侧翼序列进行鉴定，发现tom40-1突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第二个外显子上，tom40-2突变体的T-DNA位于AtTOM40基因的第七个外显子上。随后对两个突变体进行筛选和鉴定，发现其均为杂合突变体，无法获得纯合后代，同时两个突变体的雌、雄配子体发育不受影响，但在成熟角果中会出现异常的白化种子并最终死亡，两个突变体中的种子败育率分别为24.92%和25.04%，表明AtTOM40基因的突变导致胚胎隐性纯合致死。回复实验证实两个突变体的胚胎致死表型均可以被完全回复，表明AtTOM40基因的突变是造成败育的直接原因。
3、对两个突变体进行胚珠透明观察发现，从心形期胚胎开始两个突变体中的胚胎发育出现异常，不能分化出正常的子叶和顶端分生组织等器官原基，类似球形时期的胚胎。对两个突变体中胚体的高度和宽度进行测量，结果表明胚体的体积会随着发育的进程而增大，但最终会发育停滞。对野生型和两个突变体的胚胎发育进程进行统计，结果表明随着发育的进程，两个突变体中类似球形胚的占比越来越高，其最终比例分别为24.39%和24.49%，与败育率相当。对tom40-1突变体中胚乳观察的结果表明，胚乳可以正常游离核分裂和细胞化。以上结果证实AtTOM40基因的突变会引起胚胎发育异常并最终败育，AtTOM40基因在拟南芥胚胎发育过程中起着重要作用。
4、利用荧光实时定量PCR技术对AtTOM40基因的转录水平表达进行了检测，结果表明该基因在根、茎、叶、花、花序、授粉后1/3/5/7天的角果以及萌发后7天和14天的幼苗中都有表达，其中在成熟的花、花序和授粉后1天的角果中表达量较高。将AtTOM40启动子与GUS蛋白融合表达并检测GUS信号，结果显示在成熟叶片、毛状体、萌发7天的幼苗和花序中GUS信号较强，尤其是在成熟胚胎的子叶中表达强烈，但在花药、花丝、柱头等生殖器官中的GUS信号则较弱，甚至检测不到，推测AtTOM40基因参与了拟南芥营养生长和胚胎发育及器官原基分化，但不参与雌雄配子体的发育。进一步利用原位杂交技术研究了AtTOM40基因转录本在拟南芥胚胎中的表达模式，结果在不同时期的胚胎、胚乳游离核以及子叶中均检测到该基因的表达，表明AtTOM40基因参与了拟南芥胚胎和胚乳的发育过程。
5、将AtTOM40启动子与GFP蛋白进行融合表达，同时对叶肉原生质体用MitotrackerRed染色。利用激光共聚焦扫描显微镜观察转基因植株叶肉原生质体中GFP荧光定位与Mitotracker染色，结果表明叶肉原生质体中的AtTOM40蛋白与线粒体荧光存在共定位现象，显示该蛋白为线粒体蛋白。利用超薄切片和透射电镜观察的技术对线粒体超微结构进行观察，结果发现tom40-1突变体胚胎细胞中的线粒体嵴结构无法正常形成。上述结果证实了AtTOM40基因在拟南芥中定位于线粒体，该基因编码的是一个线粒体蛋白，与生物信息学的预测结果相符。同时，该基因的突变会影响胚胎细胞的线粒体结构，表明该基因参与了线粒体的生物发生，从而影响拟南芥的胚胎发育。
6、为了进一步研究AtTOM40基因的生物学功能，本研究还利用荧光实时定量PCR技术，以授粉后6天(DAP，Day after pollination)野生型种子和tom40-1突变体中白化种子为材料，对19个拟南芥线粒体外膜蛋白相关基因的表达情况进行了检测。结果发现14个基因表达发生了显著变化，证明AtTOM40基因的突变在转录水平上影响了线粒体外膜的功能，从而影响了线粒体的生物发生。对19个拟南芥胚胎发育和模式建成相关基因的表达水平也进行了检测，结果发现18个基因的表达均发生了显著变化，表明AtTOM40基因的突变导致胚胎发育和模式建成在转录水平发生变化。根据上述结果可以推测，AtTOM40基因的突变通过影响线粒体外膜功能从而影响拟南芥胚胎细胞的正常发育。
7.利用酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid)检测了拟南芥TOM40亚基与TOM复合体其他亚基之间的互作关系，结果发现TOM40能与TOM5和TOM9存在相互作用，TOM5与TOM7-1、TOM7-2、TOM9和TOM40都存在相互作用；TOM6与TOM7-1存在相互作用；TOM7-1与TOM7-2存在相互作用；TOM9与TOM7-1和TOM40存在相互作用。根据此实验结果绘制了拟南芥TOM复合体各亚基之间的互作关系示意图，为揭示TOM复合体在线粒体外膜蛋白转运过程中的作用机制提供信息。