论文部分内容阅读
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma)是一种起源于B系细胞的恶性肿瘤，其细胞学特点是B细胞分化的终末细胞浆细胞的恶性病变。多发性骨髓瘤发病率在血液系统的恶性肿瘤中占12％，居于第二位，仅次于非霍奇金淋巴瘤，且近年来发病率逐年上升。该病主要特点是患者外周血和骨髓中有大量的异常浆细胞浸润，并产生无功能的单克隆免疫球蛋白。由于患者骨髓中存在大量异常浆细胞浸润，使得骨髓三系造血功能受到抑制，患者发生病理性溶骨改变，出现病理性骨折、脊柱肿大、器官浸润、贫血、感染等全身症状。外周血中大量的单克隆免疫球蛋白导致患者常伴高粘滞血症，且大量异常免疫球蛋白的轻链经肾排出，使肾小管长期处于高代谢状态，最终导致肾小管硬化，因此晚期患者常出现肾功能衰竭，该病患者生存质量较差。目前对于多发性骨髓瘤的发病机制研究主要集中在NF-κB信号通路，该通路介导多发性骨髓瘤细胞表达粘附分子和肿瘤细胞对IL-6生长依赖性。
随着基础研究的深入，越来越多的抑制剂被应用于临床治疗肿瘤，其中一条靶通路就是泛素-蛋白酶体降解系统。该系统主要生理功能是介导细胞内源性蛋白质泛素化，进而被蛋白酶体识别，降解底物蛋白，维持细胞内环境稳态。目前已获FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂为Velcade(Bortezomib)，该药对多发性骨髓瘤的疗效显著，但是目前临床治疗现状并不乐观，42％的患者已经出现耐药现象，而且该药副作用以中性粒细胞减少症为主，进一步加重了患者感染。因此找到一种作用强，起效快，副作用小的治疗药物亟待解决。编号为Y1，W3，W4的硼酸衍生物是本实验室筛选出的三种新型蛋白酶体抑制剂。我们将继续探究三种新型蛋白酶体抑制剂对多发性骨髓瘤细胞生长的作用机制。
目的:筛选对多发性骨髓瘤细胞U266生长有抑制作用的新型蛋白酶体抑制剂，通过比较新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade对U266细胞生长抑制，诱导凋亡及小鼠体内肿瘤的作用差异，探究其在多发性骨髓瘤中的作用机制。
方法:(1)利用CCK8筛选出对多发性骨髓瘤细胞U266有抑制作用的新型蛋白酶体抑制剂，并用不同浓度处理U266细胞，Velcade浓度为2nM，4nM，8nM，10nM，Y1浓度为4nM，10nM，20nM，40nM，80nM，W3浓度为1nM，2nM，4nM，8nM，10nM，W4的浓度为2nM，4nM，8nM，10nM，20nM，处理U266细胞48h，检测各自IC50浓度，确定对U266细胞生长抑制作用最强的新型蛋白酶体抑制剂为W3。(2)利用Hoechst33342染色，正置荧光显微镜观察荧光亮度和细胞核形态方法计数凋亡细胞数，流式细胞技术检测细胞凋亡，比较新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade诱导U266细胞晚期凋亡的作用差异。(3)采用流式细胞技术检测新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade对U266细胞周期阻滞的作用差异。(4)采用Western-Blotting技术检测检测新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade增强U266细胞内源性蛋白质多聚泛素化水平，抑制p65蛋白表达的作用差异。(5)采用裸鼠成瘤实验检测新型蛋白酶体抑制剂与Velcade对体内肿瘤生长抑制作用的差异。
结果:(1)新型蛋白酶体抑制剂Y1，W3，W4可抑制多发性骨髓瘤细胞U266细胞生长，且W3对U266细胞的生长抑制作用最为显著。(2)新型蛋白酶体抑制剂W3诱导U266细胞晚期凋亡的作用强于Velcade。(3)新型蛋白酶体抑制剂W3将U266细胞周期阻滞在G2/M期的作用强于Velcade。(4)新型蛋白酶体抑制剂W3增强U266细胞中内源性蛋白质泛素化水平的作用强于Velcade，且抑制U266细胞p65蛋白表达的作用强于Velcade。(5)新型蛋白酶体抑制剂W3对小鼠体内肿瘤的生长抑制作用强于Velcade，且抑制起效时间点早于Velcade。
结论:(1)新型蛋白酶体抑制剂W3显著抑制U266，A549，H1299，HeLa细胞生长，促进U266细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞，且作用效果优于Velcade。(2)新型蛋白酶体抑制剂W3能够增强细胞内源性蛋白质多聚泛素化水平，降低单泛素水平，并且抑制U266细胞p65蛋白表达，作用效果强于Velcade。(3)新型蛋白酶体抑制剂W3抑制小鼠肿瘤的生长，起效时间点早于Velcade，且显著抑制小鼠肿瘤组织中p65表达，作用效果均优于Velcade。
随着基础研究的深入，越来越多的抑制剂被应用于临床治疗肿瘤，其中一条靶通路就是泛素-蛋白酶体降解系统。该系统主要生理功能是介导细胞内源性蛋白质泛素化，进而被蛋白酶体识别，降解底物蛋白，维持细胞内环境稳态。目前已获FDA批准用于临床治疗多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂为Velcade(Bortezomib)，该药对多发性骨髓瘤的疗效显著，但是目前临床治疗现状并不乐观，42％的患者已经出现耐药现象，而且该药副作用以中性粒细胞减少症为主，进一步加重了患者感染。因此找到一种作用强，起效快，副作用小的治疗药物亟待解决。编号为Y1，W3，W4的硼酸衍生物是本实验室筛选出的三种新型蛋白酶体抑制剂。我们将继续探究三种新型蛋白酶体抑制剂对多发性骨髓瘤细胞生长的作用机制。
目的:筛选对多发性骨髓瘤细胞U266生长有抑制作用的新型蛋白酶体抑制剂，通过比较新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade对U266细胞生长抑制，诱导凋亡及小鼠体内肿瘤的作用差异，探究其在多发性骨髓瘤中的作用机制。
方法:(1)利用CCK8筛选出对多发性骨髓瘤细胞U266有抑制作用的新型蛋白酶体抑制剂，并用不同浓度处理U266细胞，Velcade浓度为2nM，4nM，8nM，10nM，Y1浓度为4nM，10nM，20nM，40nM，80nM，W3浓度为1nM，2nM，4nM，8nM，10nM，W4的浓度为2nM，4nM，8nM，10nM，20nM，处理U266细胞48h，检测各自IC50浓度，确定对U266细胞生长抑制作用最强的新型蛋白酶体抑制剂为W3。(2)利用Hoechst33342染色，正置荧光显微镜观察荧光亮度和细胞核形态方法计数凋亡细胞数，流式细胞技术检测细胞凋亡，比较新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade诱导U266细胞晚期凋亡的作用差异。(3)采用流式细胞技术检测新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade对U266细胞周期阻滞的作用差异。(4)采用Western-Blotting技术检测检测新型蛋白酶体抑制剂W3与Velcade增强U266细胞内源性蛋白质多聚泛素化水平，抑制p65蛋白表达的作用差异。(5)采用裸鼠成瘤实验检测新型蛋白酶体抑制剂与Velcade对体内肿瘤生长抑制作用的差异。
结果:(1)新型蛋白酶体抑制剂Y1，W3，W4可抑制多发性骨髓瘤细胞U266细胞生长，且W3对U266细胞的生长抑制作用最为显著。(2)新型蛋白酶体抑制剂W3诱导U266细胞晚期凋亡的作用强于Velcade。(3)新型蛋白酶体抑制剂W3将U266细胞周期阻滞在G2/M期的作用强于Velcade。(4)新型蛋白酶体抑制剂W3增强U266细胞中内源性蛋白质泛素化水平的作用强于Velcade，且抑制U266细胞p65蛋白表达的作用强于Velcade。(5)新型蛋白酶体抑制剂W3对小鼠体内肿瘤的生长抑制作用强于Velcade，且抑制起效时间点早于Velcade。
结论:(1)新型蛋白酶体抑制剂W3显著抑制U266，A549，H1299，HeLa细胞生长，促进U266细胞凋亡，诱导细胞周期阻滞，且作用效果优于Velcade。(2)新型蛋白酶体抑制剂W3能够增强细胞内源性蛋白质多聚泛素化水平，降低单泛素水平，并且抑制U266细胞p65蛋白表达，作用效果强于Velcade。(3)新型蛋白酶体抑制剂W3抑制小鼠肿瘤的生长，起效时间点早于Velcade，且显著抑制小鼠肿瘤组织中p65表达，作用效果均优于Velcade。