蚬壳花椒ZdPOD1、ZdPOD2同工酶基因的克隆和表达研究

• 作 者: 贾浩
• 机 构: 中南林业科技大学
• 出 处: 中南林业科技大学
• 发表日期: 2019年6期
• 关键词: 蚬壳花椒

蚬壳花椒(Zdnthoxylum dissitum Hesl)，又名单面针，是我国多种中成药的重要原料，市场需求量极大，而当前的蚬壳花椒一直处于野生状态，且因萌发困难、无节制的开采与利用等因素，导致其物种资源已濒临近危。因此，提高蚬壳花椒种子萌发率，打破木本植物种子的休眠机制，已经成为解决其资源量匮乏的重要基础研究方向。研究表明，过氧化物酶拥有一个庞大的基因家族，在植物的生长发育过程中参与活性氧的去除、生长素代谢、植物防御等生理过程，对种子的萌发也有调控作用。本研究对蚬壳花椒过氧化物酶同工酶ZdPOD1和ZdPOD2，利用基因克隆、表达、酵母裂解以及RT-PCR等方法对其在种子不同萌发时期的表达规律以及功能进行分析。主要的研究结果如下:
　　(1)通过过氧化物酶基因家族分析ZdPOD1、ZdPOD2预测其功能分别与种子萌发初期活性氧的祛除和种子萌发后期胚根的伸长与细胞壁的松弛相关。克隆目的基因并对其进行生物信息学分析可得:ZdPOD1序列全长1056个碱基，编码氨基酸残基351个，理论分子量大小为38.24KD，为弱酸性、稳定的信号肽蛋白;ZdPOD2序列全长956个碱基，编码氨基酸残基331个，理论分子量大小为37.57KD，为碱性、不稳定的信号肽蛋白;保守域预测分析表明ZdPOD1和ZdPOD2同属于ClassⅢ过氧化物酶，拥有secretory-peroxidase结构域，归于植物过氧化物酶超家族;构建的系统发育树符合遗传规律，ZdPOD1和ZdPOD2相距较远，有明显的功能分化现象，与预期推测相符。
　　(2)重组酵母菌液PCR验证后合理推测ZdPOD2对酵母细胞的细胞壁的结构有一定的加固作用，与ZdPOD2参与胚根伸长和细胞壁中木质素合成过程的结论相吻合。超声破碎诱导表达后的重组酵母菌体获得酵母总蛋白，经SDS-PAGE检测，分别在38.24KD和37.57KD处发现ZdPOD1和ZdPOD2目的蛋白。酶活性测定表明:空酵母酶活性为0.77±0.05U/mL，ZdPOD1重组酵母蛋白酶活性为20.95±0.39U/mL，ZdPOD2重组酵母酶活性为22.75±0.54U/mL。综合以上结果可表明ZdPOD1和ZdPOD2在酿酒酵母中成功表达，并具有生物活性。
　　(3)ZdPOD1和ZdPOD2在蚬壳花椒种子萌发和根的生长和发育过程不同时期的表达量变化表明:ZdPOD1基因的表达主要集中于种子萌发的前期，ZdPOD2基因的表达集中于种子萌发后期以及根的生长发育阶段，整体变化趋势其结果与过氧化物酶的酶活性的测定结果相吻合;测定重组酵母破碎率发现空酵母、ZdPOD1重组酵母、ZdPOD2重组酵母的破碎率为71.52±3.59％、67.17±2.04％、57.17±2.22％，经单因素方差显著性分析发现，空酵母与ZdPOD1重组酵母、ZdPOD2重组酵母之间分别存在不显著差异(P值=0.142)与极显著差异(P值=0.004)。综合以上结果，可初步证实ZdPOD1在蚬壳花椒种子萌发初期侧重于调控活性氧的水平以避免造成细胞生物膜的氧化损伤，而ZdPOD2作用于种子萌发后期，参与胚根的伸长和木质素的形成过程。