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蛋白质设计一项充满希望又极具挑战性的领域。将蛋白质的理论设计与实验手段相结合，是蛋白质设计工作中的重要一环。本文围绕设计蛋白质相互作用功能的检测体系的构建，蛋白质设计在提升蛋白质热稳定性上的应用，设计蛋白质的结构与功能的分析，蛋白质热稳定性中的上位作用几个问题展开研究和讨论。
本研究构建了一系列用于蛋白质-蛋白质相互作用实验鉴定以及定向进化的系统。本系统是基于小鼠和大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(DHFR)的蛋白质片段互补系统(PCA)，致力于对具有相互作用功能的从头设计蛋白质进行效率高、准确率高、通量高的鉴定。在本文中，我们构建了具有高灵敏度，通量高，假阻性率低的基于小鼠DHFR的PCA系统，以及高度可调的基于大肠杆菌DHFR的PCA系统。通过两套系统的配合使用，我们基本可以实现对不同强度的蛋白质-蛋白质的相互作用的检测，区分以及相互作用强度的定向进化。
采用氨基酸序列重设计的方法，本文发展了在保留蛋白质的结构和功能的前提下，提升蛋白质热稳定性的新策略。我们以天然蛋白质Raf的Ras结合结构域Raf-RBD为目标主链结构，使用ABACUS程序对Raf-RBD进行固定主链的序列重设计。在计算中，位于Ras结合界面的氨基酸残基类型保持不变，其他位点的氨基酸残基被重新设计。我们通过DHFR_PCA系统对十条设计序列与H-Ras的特异性结合能力用进行了测试。所有重设计的蛋白质均保持了与Ras的相互作用功能。我们通过DSF，DSC和HSQC等实验手段对其中的四个设计蛋白质的热稳定性进行分析，设计蛋白的热稳定性都远高于天然蛋白质Raf-RBD。
设计蛋白dRafX6表现出了极高的热稳定性和较强的与Ras相互作用的能力。其热变性温度相较于天然蛋白提高了近40℃。我们对dRafX6的结构和功能进行了进一步的研究和分析，包括用核磁共振方法解析了dRafX6的三维溶液结构，验证了dRafX6的实际空间结构及其与Ras结合方式符合设计的预期。在此基础上，我们结合计算和实验手段探索设计蛋白dRafX6具有超高热稳定性的序列和结构机制。基于ABACUS点突变能量计算，我们在dRafX6和Raf-RBD上分别选择了若干个突变位点，构建了一系列中间突变体，并对突变体的热稳定性进行分析。实验结果表明，dRafX6相对于Raf-RBD高热稳定性更多地是一种对序列整体进行重设计后的效应，而不能归结为个别位点突变效应:从天然Raf-RBD的氨基酸序列出发，难以通过少数几个位点向dRafX6中相应残基类型的突变使热稳定性得到显著提升;反过来，从设计蛋白质dRafX6出发，单个位点突变就可能导致热稳定性明显降低。这一结果表明，采用对序列整体进行计算设计得到的热稳定性提升，不同于基于个别位点分析的突变位点和突变效果预测。本文采用的在保留功能区域不变的前提下重新设计序列的策略具有普适性。本文验证了该策略的有效性，可推广到其他功能蛋白的重设计。
本研究通过对dRafX6和Raf-RBD的突变体的热稳定性检测，分析蛋白质热稳定性中的上位作用，分析了上位作用存在的机制和影响。本文研究表明，相同的突变在不同的遗传背景下具有不同的稳定性效应，同时我们发现表面静电相互作用，氢键和疏水性等都是产生上位作用的原因，并在热稳定性中起着重要功能。
本研究构建了一系列用于蛋白质-蛋白质相互作用实验鉴定以及定向进化的系统。本系统是基于小鼠和大肠杆菌的二氢叶酸还原酶(DHFR)的蛋白质片段互补系统(PCA)，致力于对具有相互作用功能的从头设计蛋白质进行效率高、准确率高、通量高的鉴定。在本文中，我们构建了具有高灵敏度，通量高，假阻性率低的基于小鼠DHFR的PCA系统，以及高度可调的基于大肠杆菌DHFR的PCA系统。通过两套系统的配合使用，我们基本可以实现对不同强度的蛋白质-蛋白质的相互作用的检测，区分以及相互作用强度的定向进化。
采用氨基酸序列重设计的方法，本文发展了在保留蛋白质的结构和功能的前提下，提升蛋白质热稳定性的新策略。我们以天然蛋白质Raf的Ras结合结构域Raf-RBD为目标主链结构，使用ABACUS程序对Raf-RBD进行固定主链的序列重设计。在计算中，位于Ras结合界面的氨基酸残基类型保持不变，其他位点的氨基酸残基被重新设计。我们通过DHFR_PCA系统对十条设计序列与H-Ras的特异性结合能力用进行了测试。所有重设计的蛋白质均保持了与Ras的相互作用功能。我们通过DSF，DSC和HSQC等实验手段对其中的四个设计蛋白质的热稳定性进行分析，设计蛋白的热稳定性都远高于天然蛋白质Raf-RBD。
设计蛋白dRafX6表现出了极高的热稳定性和较强的与Ras相互作用的能力。其热变性温度相较于天然蛋白提高了近40℃。我们对dRafX6的结构和功能进行了进一步的研究和分析，包括用核磁共振方法解析了dRafX6的三维溶液结构，验证了dRafX6的实际空间结构及其与Ras结合方式符合设计的预期。在此基础上，我们结合计算和实验手段探索设计蛋白dRafX6具有超高热稳定性的序列和结构机制。基于ABACUS点突变能量计算，我们在dRafX6和Raf-RBD上分别选择了若干个突变位点，构建了一系列中间突变体，并对突变体的热稳定性进行分析。实验结果表明，dRafX6相对于Raf-RBD高热稳定性更多地是一种对序列整体进行重设计后的效应，而不能归结为个别位点突变效应:从天然Raf-RBD的氨基酸序列出发，难以通过少数几个位点向dRafX6中相应残基类型的突变使热稳定性得到显著提升;反过来，从设计蛋白质dRafX6出发，单个位点突变就可能导致热稳定性明显降低。这一结果表明，采用对序列整体进行计算设计得到的热稳定性提升，不同于基于个别位点分析的突变位点和突变效果预测。本文采用的在保留功能区域不变的前提下重新设计序列的策略具有普适性。本文验证了该策略的有效性，可推广到其他功能蛋白的重设计。
本研究通过对dRafX6和Raf-RBD的突变体的热稳定性检测，分析蛋白质热稳定性中的上位作用，分析了上位作用存在的机制和影响。本文研究表明，相同的突变在不同的遗传背景下具有不同的稳定性效应，同时我们发现表面静电相互作用，氢键和疏水性等都是产生上位作用的原因，并在热稳定性中起着重要功能。