论文部分内容阅读
研究背景抗生素的发现使很多曾经致命的感染性疾病得以治愈,为人类健康做出了巨大的贡献,是人类医学史上的伟大变革。但是抗生素的应用和滥用导致了耐药菌株的不断增多,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）就是其中之一。近20年来,由MRSA引起的的眼部感染性疾病的发病率越来越高,由于MRSA对现有抗生素的多重耐药,使该疾病的临床治疗陷入困境。美国一项研究显示,在33株由细菌性角膜炎分离出的MRSA菌株中,仅15.2%对左氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星敏感。因此,迫切需要研发新的抗菌药物,来应对日益严峻的耐药菌感染问题。近年来有研究显示过渡族金属硫化物量子点（XS2 QDs,X为W或Mo元素）可以通过其光热、光催化等性质达到杀菌作用,对细菌引起的皮肤感染等有很好的治疗效果,有望成为新一代高效抗菌药物。但与其他用药途径不同,在眼表局部滴用滴眼剂具有特殊性,现有的XS2 QDs难以满足治疗要求。首先,由于鼻泪管引流和泪液冲刷等清除机制,滴眼液在眼表停留时间短暂,仅有20分钟左右,因此要求药物具备快速杀菌的作用,但是现有的XS2 QDs实现99.9%以上的灭菌率,需要超过1小时的作用时间。其次,眼睛作为一个重要的屈光系统,在治疗中应避免长时间和强烈的光照,以免引起视网膜的光损伤,但是现有的XS2 QDs的抗菌活性依赖于光热及光催化作用,杀菌过程中强烈的光照是不可避免的。因此,为开发适用于眼部细菌感染性疾病治疗的新型药物,需要对纳米材料的杀菌性质进行优化,使其适用于眼部局部应用。研究方法和结果在本研究工作中,我们借助离子束辐照方法,对纳米材料的微观结构进行调控,导致其物理、化学性质的变化,使其具备满足眼部炎症治疗需求的快速且不依赖于光照的杀菌性能。具体研究中,我们选取的研究对象是WS2量子点（WS2 QDs）,采用能量为500keV的金离子轰击纳米材料,溅射材料表面的硫原子,造成空位结构,调控其杀菌能力。实验结果表明,离子束辐照过程使WS2 QDs产生硫元素缺失,S与W间的元素比由2降低至2-y（WS2-y,y=0-0.11）。我们选取金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.Coli）和MRSA,采用经典的平板菌落计数的方法,在避光和使用医用冷光源模拟日常光照两个条件下,对辐照前后QDs的杀菌效果进行了测试。结果显示在QDs为60μg/ml的浓度下,未辐照的WS2 QDs没有杀菌效果,而辐照后的WS2-y QDs显示出了强大的杀菌效果。随着硫元素丢失率由y=0增至y=0.1,WS2-y QDs的杀菌效果逐渐增强。在作用时间为20min时,WS2-0.1 QDs对S.aureus的失活率高达3.0[-log10（C/C0）],但是进一步降低硫元素的含量至y=0.11,WS2-0.11 QDs对S.aureus的失活率回落至2.0[-log10（C/C0）]。说明离子辐照产生的硫空位使QDs具有了杀菌性质,但是杀菌效率和硫空位含量两者之间并不是呈直线正相关的,当硫丢失量超过某一最佳值时,WS2-y QDs的杀菌效率会降低。光照会使WS2-y QDs的杀菌效率略有提高但不是必须条件,在避光的条件下,WS2-y QDs也有非常理想的杀菌效果。同时,WS2-y QDs对MRSA的杀菌效果与S.aureus基本一致。但是与S.aureus相比,在相同条件下,WS2-y QDs对E.Coli的杀菌效果略差,最高失活率为70%。以上说明,离子束辐照的方法可以调控WS2 QDs的杀菌性质,使其产生不依赖于光照的快速杀菌（20分钟内）性质。离子束辐照后生成的WS2-y QDs可以满足眼部炎症的治疗要求。进一步分析WS2-y QDs的杀菌机制。通过对WS2-y QDs处理后灭活的金黄色葡萄球菌的扫描电镜和透射电镜检查,我们发现金葡菌菌壁保持完整,量子点主要是吸附在菌体表面,没有刺入细胞壁,说明WS2-y QDs不是通过破坏细胞壁起到杀菌作用。在Ellman’s实验中,WS2-y QDs表现出了对谷胱甘肽的强氧化性,且WS2-y QDs的氧化性从S1-S4逐渐增强,而S5有所回落,这一趋势与其杀菌效果的变化趋势相同。通过XTT、TA及ESR实验,我们证实了 WS2-y QDs并不能产生活性氧自由基（ROS,Reactive oxygen species）。由此可以说明WS2-y QDs的杀菌机制是WS2-y QDs与细菌之间发生了不依赖于光照的非ROS的氧化应激反应。为了探究该氧化性产生的来源,我们借助氧化还原的电子转移的本质,对该机制提出了理论解释。由于硫缺陷降低了 QDs的功函数,使其与谷胱甘肽、细菌接触时,电子只能单向流入QDs,QDs接收电子,表现出氧化性。为验证该理论,我们设计了一款新型的生物电流探测器,发现了由QDs引起的单向细菌生物电流。同时这一理论也很好的解释了 QDs对E.Coli杀菌作用较弱的现象。为了验证WS2-y QDs的安全性和有效性,我们选取杀菌效果最好的WS2-0.1 QDs进行细胞试验和动物试验。我们采用CCK-8方法测试不同浓度的WS2 QDs和WS2-0.1 QDs对人结膜上皮细胞活性的影响,并观察不同浓度下WS2-0.1 QDs对大鼠角膜组织的损伤。结果表明:在有效杀菌浓度下,WS2-y QDs对人结膜上皮细胞的活性没有影响,对角膜组织没有明显损伤,将其作为治疗眼部炎症性疾病的局部用药是安全的。鉴于WS2-0.1 QDs优越的杀菌性和良好的生物安全性,我们制作了大鼠MRSA角膜炎模型,验证WS2-0.1 QDs对角膜炎的治疗作用。结果显示接受WS2-0.1 QDs治疗的实验组,其角膜炎症评分及眼部炎症表现及病理学检查都明显优于对照组,表现出了良好的治疗效果。证明WS2-0.1 QDs可以有效的缓解MRSA角膜炎的炎症反应。结论在本研究中,我们发现离子束辐照方法可以赋予WS2 QDs强氧化性。WS2-0.1 QDs的强氧化性使其产生了对金黄色葡萄球菌及MRSA良好的杀菌作用。进一步阐述了 WS2-y QDs的非ROS依赖的氧化应激的杀菌机制,并探究了 WS2-y QDs用于眼部炎症治疗的可能性。为研究新型抗菌药物提供了新的思路和方法,具有很好的应用前景。