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目的
探讨慢病毒介导的热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)表达对缺氧状态下嗜铬细胞瘤细胞(PC12)内质网钙稳态的影响及内质网钙通道的调节。
方法
构建表达外源性HSP70的重组慢病毒，感染对数生长期的嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞，用嘌呤霉素筛选稳定表达HSP70基因的PC12细胞作为实验组，即重组慢病毒感染组，同时设置慢病毒对照组和细胞对照组(即正常对照组)。对3组细胞分别进行4h,8h,12h,24h缺氧处理，采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组细胞不同缺氧条件下细胞活性，选取最佳缺氧时间。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-timequantitativePCR,qRT-PCR)检测缺氧8h时HSP70，肌浆/内质网Ca2+-ATP酶亚型(SERCA2a,SERCA2b)，兰尼碱受体2(RyR2)，三磷酸肌醇受体1(IP3R1)的mRNA转录水平；采用蛋白质免疫印迹实验(WesternBlot)检测缺氧8h时HSP70,SERCA,IP3R蛋白表达水平；采用流式细胞仪检测细胞生成活性氧(ROS)浓度及细胞内游离钙离子([Ca2+]i)浓度水平。
结果
①随着缺氧时间延长，各组细胞活性呈先增强后减弱的趋势，8h时达峰值，故采用8h作为缺氧细胞钙超载模型；MTT检测结果显示，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时，其细胞吸光度(A值)分别为0.203±0.022,0.141±0.021和0.140±0.016;统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞活性明显高于其他2组(t1=8.524,P1＜0.05;t2=8.229,P2＜0.05)。②qRT-PCR检测结果显示，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时PC12细胞的mRNA转录水平分别为HSP70mRNA(2-ΔΔCt)：0.785±0.018,0.428±0.019和0.423±0.023，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞HSP70mRNA转录水平明显高于其他2组(t1=5.241,P1＜0.05;t2=5.552,P2＜0.05)；SERCA2amRNA(2-ΔΔCt)：0.971±0.037,0.367±0.014和0.347±0.0121，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞SERCA2amRNA转录水平明显高于其他2组(t1=9.071,P1＜0.05;t2=9.596,P2＜0.05)；SERCA2bmRNA(2-ΔΔCt)：8.869±0.162,3.015±0.0908和2.941±0.0914，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞SERCA2bmRNA转录水平明显高于其他2组(t1=7.646,P1＜0.05;t2=8.364P2＜0.05)；IP3RmRNA转录水平分别为mRNA(2-ΔΔCt)：0.183±0.020,0.439±0.020和0.433±0.040，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞IP3RmRNA转录水平明显低于其他2组(t1=-8.376,P1＜0.05;t2=-7.99,P2＜0.05)。③WesternBlot检测结果显示，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时PC12细胞蛋白表达分别为HSP70蛋白(灰度比值)：2.720±0.200,1.560±0.360和1.630±0.410，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞HSP70蛋白表达明显高于其他2组(t1=4.363,P1＜0.05;t2=3.975,P2＜0.05)；SERCA蛋白(灰度比值)：2.840±0.180,1.480±0.260,1.520±0.290，统学分析表明，重组慢病毒感染组细胞SERCA蛋白表达明显高于其他2组(t1=5.254,P1＜0.05;t2=4.897,P2＜0.05)；IP3R蛋白(灰度比值)：1.150±0.120比1.910±0.200,1.830±0.190，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞IP3R蛋白表达明显低于其他2组(t1=-4.736,P1＜0.05;t2=-4.257,P2＜0.05)。④重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)相对浓度(即ROS相对荧光强度)，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时，ROS相对荧光强度(U/孔)分别为：30.540±1.230,58.030±1.970和57.720±2.350，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞ROS明显低于其他2组(t1=-7.108,P1＜0.05;t2=-7.899,P2＜0.05)。流式细胞仪检测细胞内游离钙离子相对浓度(即[Ca2+]i相对荧光强度)，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时，细胞内[Ca2+]i相对荧光强度(U/孔)分别为：34.500±2.050,48.200±3.020和46.800±2.750，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞内[Ca2+]i相对荧光强度明显低于其他2组(t1=-6.088P1＜0.05;t2=-5.367,P2＜0.05)。
结论
缺氧可导致嗜铬细胞瘤细胞(PC12)内游离钙离子浓度增加，降低细胞活性；缺氧时间不同，其细胞活性不同，缺氧8h可作为细胞钙超载模型；缺氧后外源性HSP70表达可对细胞内IP3R及SERCA调控Ca2+通道蛋白具有显著影响，进而维持PC12细胞内质网钙稳态，即外源性HSP70表达可能通过调节内质网中钙通道调节因子，对缺氧所致的PC12细胞损伤起到一定的保护作用；并且为神经系统早期损伤起到预防性保护作用提供一定的实验依据。
探讨慢病毒介导的热休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)表达对缺氧状态下嗜铬细胞瘤细胞(PC12)内质网钙稳态的影响及内质网钙通道的调节。
方法
构建表达外源性HSP70的重组慢病毒，感染对数生长期的嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞，用嘌呤霉素筛选稳定表达HSP70基因的PC12细胞作为实验组，即重组慢病毒感染组，同时设置慢病毒对照组和细胞对照组(即正常对照组)。对3组细胞分别进行4h,8h,12h,24h缺氧处理，采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测各组细胞不同缺氧条件下细胞活性，选取最佳缺氧时间。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-timequantitativePCR,qRT-PCR)检测缺氧8h时HSP70，肌浆/内质网Ca2+-ATP酶亚型(SERCA2a,SERCA2b)，兰尼碱受体2(RyR2)，三磷酸肌醇受体1(IP3R1)的mRNA转录水平；采用蛋白质免疫印迹实验(WesternBlot)检测缺氧8h时HSP70,SERCA,IP3R蛋白表达水平；采用流式细胞仪检测细胞生成活性氧(ROS)浓度及细胞内游离钙离子([Ca2+]i)浓度水平。
结果
①随着缺氧时间延长，各组细胞活性呈先增强后减弱的趋势，8h时达峰值，故采用8h作为缺氧细胞钙超载模型；MTT检测结果显示，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时，其细胞吸光度(A值)分别为0.203±0.022,0.141±0.021和0.140±0.016;统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞活性明显高于其他2组(t1=8.524,P1＜0.05;t2=8.229,P2＜0.05)。②qRT-PCR检测结果显示，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时PC12细胞的mRNA转录水平分别为HSP70mRNA(2-ΔΔCt)：0.785±0.018,0.428±0.019和0.423±0.023，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞HSP70mRNA转录水平明显高于其他2组(t1=5.241,P1＜0.05;t2=5.552,P2＜0.05)；SERCA2amRNA(2-ΔΔCt)：0.971±0.037,0.367±0.014和0.347±0.0121，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞SERCA2amRNA转录水平明显高于其他2组(t1=9.071,P1＜0.05;t2=9.596,P2＜0.05)；SERCA2bmRNA(2-ΔΔCt)：8.869±0.162,3.015±0.0908和2.941±0.0914，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞SERCA2bmRNA转录水平明显高于其他2组(t1=7.646,P1＜0.05;t2=8.364P2＜0.05)；IP3RmRNA转录水平分别为mRNA(2-ΔΔCt)：0.183±0.020,0.439±0.020和0.433±0.040，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞IP3RmRNA转录水平明显低于其他2组(t1=-8.376,P1＜0.05;t2=-7.99,P2＜0.05)。③WesternBlot检测结果显示，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时PC12细胞蛋白表达分别为HSP70蛋白(灰度比值)：2.720±0.200,1.560±0.360和1.630±0.410，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞HSP70蛋白表达明显高于其他2组(t1=4.363,P1＜0.05;t2=3.975,P2＜0.05)；SERCA蛋白(灰度比值)：2.840±0.180,1.480±0.260,1.520±0.290，统学分析表明，重组慢病毒感染组细胞SERCA蛋白表达明显高于其他2组(t1=5.254,P1＜0.05;t2=4.897,P2＜0.05)；IP3R蛋白(灰度比值)：1.150±0.120比1.910±0.200,1.830±0.190，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞IP3R蛋白表达明显低于其他2组(t1=-4.736,P1＜0.05;t2=-4.257,P2＜0.05)。④重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)相对浓度(即ROS相对荧光强度)，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时，ROS相对荧光强度(U/孔)分别为：30.540±1.230,58.030±1.970和57.720±2.350，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞ROS明显低于其他2组(t1=-7.108,P1＜0.05;t2=-7.899,P2＜0.05)。流式细胞仪检测细胞内游离钙离子相对浓度(即[Ca2+]i相对荧光强度)，重组慢病毒感染组、正常对照组和慢病毒对照组缺氧8h时，细胞内[Ca2+]i相对荧光强度(U/孔)分别为：34.500±2.050,48.200±3.020和46.800±2.750，统计学分析表明，重组慢病毒感染组细胞内[Ca2+]i相对荧光强度明显低于其他2组(t1=-6.088P1＜0.05;t2=-5.367,P2＜0.05)。
结论
缺氧可导致嗜铬细胞瘤细胞(PC12)内游离钙离子浓度增加，降低细胞活性；缺氧时间不同，其细胞活性不同，缺氧8h可作为细胞钙超载模型；缺氧后外源性HSP70表达可对细胞内IP3R及SERCA调控Ca2+通道蛋白具有显著影响，进而维持PC12细胞内质网钙稳态，即外源性HSP70表达可能通过调节内质网中钙通道调节因子，对缺氧所致的PC12细胞损伤起到一定的保护作用；并且为神经系统早期损伤起到预防性保护作用提供一定的实验依据。