黑曲霉乳糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

• 作 者: 李淑娟
• 机 构: 河北农业大学
• 出 处: 河北农业大学
• 发表日期: 2007年01期
• 关键词: 黑曲霉乳糖酶 基因克隆 毕赤酵母 乳制品 乳糖不耐症

乳及乳制品是人类改善营养、增强体质的理想食品。牛乳中含有5％左右的乳糖，我国人群中有很大一部分人(约75％～95％)患有乳糖不耐受症，严重影响乳及乳制品的推广。乳糖酶能将乳制品中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，利用乳糖酶生产低乳糖制品或口服酶制剂，能够有效解决“乳糖不耐症”问题。 本研究从一株产乳糖酶的黑曲霉Aspergillus niger DL116中克隆获得乳糖酶DNA和cDNA序列，经过序列分析显示，乳糖酶基因DNA序列长3368 bp，其中含有8个内含子，cDNA编码区长2967 bp，GC含量为52.8％，共编码988个氨基酸，氨基酸序列中共含有12个潜在的N-糖基化位点。此基因已在GENBANK中注册，登录号为：ACCESSION No.EF103141。 将乳糖酶cDNA序列克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K上，电击转化Pichiapastoris GS115，经过MM、MD平板筛选出156株GS115 His<+>Mut<+>表型转化子，并对重组酵母进行乳糖酶基因的PCR分析，选取65株PCR检测阳性的酵母转化子进行乳糖酶活性筛选，获得一株高效表达乳糖酶的重组酵母工程菌，将此菌株命名为LAC-47，对其进行摇瓶培养，甲醇诱导12 d后乳糖酶活力达到271.15 U/mL，表达量为0.66mg/mL。 将发酵液经过超滤浓缩、透析、DEAE-52纤维素离子交换层析及Sephacry1S-200分子筛层析进行分离纯化。纯化后该酶经PAGE电泳鉴定为单一条带，达到电泳纯，单亚基分子量为130～140 kD，比活力从粗酶液的275.5 U/mg提高到532.9U/mg。 对表达的乳糖酶进行了酶学性质的研究，其酶促反应最适温度为60℃，60℃下保温1 h酶活基本不变；最适反应pH在3.0～4.2之间，并且pH稳定性较好，在pH2.5～9.0范围内较稳定，尤其在pH7.5～9.0范围内处理2 d，酶活均保持在94％以上，说明该酶有很好的耐碱性。所试离子和化学试剂对酶促反应的影响不大，其中K<+>，pb<2+>，Mg<2+>，Fe<2+>略有激活作用，SDS略有抑制作用，EDTA对该酶影响不显著，从而可以推知这是一种不依赖于金属离子的酶蛋白。60℃，pH3.8条件下，以ONPG为底物，采用双倒数作图法，测定其K<,m>值为2.43 mmol/L，V<,max>值为1.52μmol/min。