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[目的]
本实验通过研究用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的Wistar大鼠肝癌模型进行肝脏肿瘤组织标本离体高分辨魔角旋转1H波谱分析，并对照组织学检查结果，从分子水平研究肝脏肿瘤及正常组织的代谢改变。
[方法]
1.动物模型的建立：
Wistar1月龄大鼠65只，随机分为两组：实验组50只，对照组15只。
实验组(n=50)，按体重于腹腔内注射70mg/kg DEN(纯度为99.9％)，每周一次，共注射10周，从第17周末开始，每周随机对5-6只进行肿瘤组织样本提取，直至第25周末。其中，从中后期开始，陆续死亡9只。
对照组：(n=15)，给予正常基础饲料喂养。从第17周末开始，每隔一周对其中随机1-2只进行组织样本提取，直至第25周末。实验结束，无死亡。整个实验过程为27周。
2.样本的采集及离体组织块样本制备：
收集肿瘤样本将其一分为二，一半置入液氮冷冻后迅速放入-80℃冰箱保存，送至离体高分辨魔角旋转质子波谱分析，另一半送至病理；对照组亦相同。
行高分辨魔角旋转质子波谱分析时，切下大约重量约为15mg肝脏组织样品装入ZrO2转子后进行波谱分析。
3.离体组织块高分辨波谱分析方法：
通过专用波谱分析软件，经基线校正、滤噪、浓度校正、化学位移的校正，在谱峰检测及谱峰匹配后过滤掉可能引起误差的峰，利用OPLS、wilcoxon秩和检验及HottelingsT2检验方法对数据进行统计分析，并结合化合物的化学位移，进行波峰指认。
[结果]
1.病理结果：
实验总过程为27周，其中，实验中后期实验组大鼠开始死亡9只，存活率为82％。对照组无死亡。肝脏病理证实对照组均为正常肝脏；实验组病理提示胆管细胞癌3例、不典型性增生6例、腺瘤样增生1例、肝细胞癌31例。其中肝细胞癌Ⅰ级14例，Ⅱ级4例，Ⅲ级7例，Ⅳ级6例。
2.HR-MAS MRS结果：
所得的有效波谱数为26例(正常对照组11例；肝脏肿瘤组15例，其中肝细胞癌10例，胆管细胞癌1例，腺瘤样增生1例，不典型性增生3例)。经波谱分析及波峰指认，可得出以下结果：
①正常对照组其胆碱、甘油磷酸胆碱、β-葡萄糖、α-葡萄糖、甘油三酯相对浓度分别为11.2±3.4、7.04±3.10、11.7±4.81、29.1±4.71，13.3±12.1，而DEN处理组其相对浓度为2.41±2.00、1.18±1.26、2.40±3.57、11.9±7.32，1.24±2.16，说明以上代谢物在正常肝脏组相对含量高于经DEN处理的肝脏肿瘤组(P＜0.05)。DEN处理组的谷氨酸、异亮氨酸、赖氨酸的相对浓度分别为4.57±2.28、6.34±3.40、5.83±3.88，均高于正常对照组的0.245±0.400、0.406±0.59、0.425±0.618(P＜0.05)。
②肝细胞癌与其他病理类型病变(胆管细胞癌、不典型性增生、腺瘤样增生)：肝细胞癌中胆碱的相对浓度为2.39±1.42，高于其他病理类型的0.242±0.387(P＜0.05)。其它差异较大的有赖氨酸，它在肝细胞癌中浓度相对较高，但P＞0.05，这可能是因为样本量比较少造成。
③由于肝细胞癌不同级别所含的样本量少，无法行统计检验。但在不同分级的肝细胞癌的代谢物分析中，可见糖原+葡萄糖相对浓度在肝细胞癌Ⅰ级中明显高于Ⅱ-Ⅳ级；丙氨酸在Ⅰ-Ⅲ级中基本上未检测到，而在Ⅳ级相对含量明显增高。
[结论]
1.本研究结果表明，通过DEN诱导成功制备了大鼠肝癌模型，为肝脏肿瘤的离体高分辨魔角旋转质子波谱分析提供了可靠的动物模型。
2.本研究采用离体高分辨魔角旋转核磁共振技术，避免组织萃取等复杂处理过程引入的误差因素，同时得到高分辨谱图，既提高了图谱谱峰指认的准确度，又降低了统计分析的误差。
3.以OPLS(正交信号校正偏最小二乘法)将肝癌和其它病理类型的肝组织代谢物及不同分级肝癌的代谢物差异很好的区分出来。与大鼠正常肝脏组织比较，经DEN处理肝脏肿瘤组织的谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)相对浓度升高(P＜0.05)；正常肝脏胆碱(Cho)、甘油磷酸胆碱(GPC)、葡萄糖+糖原(Glc+Gly)、α[-葡萄糖(α-Glc)、β-葡萄糖(β-Glc)及甘油三酯(TG)含量高于肿瘤组织(P＜0.05)；肝细胞癌较其他病理类型具有相对高的胆碱含量(P＜0.05)。低分化的肝癌与高分化肝癌也体现出代谢产物的差异趋势。
本实验通过研究用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的Wistar大鼠肝癌模型进行肝脏肿瘤组织标本离体高分辨魔角旋转1H波谱分析，并对照组织学检查结果，从分子水平研究肝脏肿瘤及正常组织的代谢改变。
[方法]
1.动物模型的建立：
Wistar1月龄大鼠65只，随机分为两组：实验组50只，对照组15只。
实验组(n=50)，按体重于腹腔内注射70mg/kg DEN(纯度为99.9％)，每周一次，共注射10周，从第17周末开始，每周随机对5-6只进行肿瘤组织样本提取，直至第25周末。其中，从中后期开始，陆续死亡9只。
对照组：(n=15)，给予正常基础饲料喂养。从第17周末开始，每隔一周对其中随机1-2只进行组织样本提取，直至第25周末。实验结束，无死亡。整个实验过程为27周。
2.样本的采集及离体组织块样本制备：
收集肿瘤样本将其一分为二，一半置入液氮冷冻后迅速放入-80℃冰箱保存，送至离体高分辨魔角旋转质子波谱分析，另一半送至病理；对照组亦相同。
行高分辨魔角旋转质子波谱分析时，切下大约重量约为15mg肝脏组织样品装入ZrO2转子后进行波谱分析。
3.离体组织块高分辨波谱分析方法：
通过专用波谱分析软件，经基线校正、滤噪、浓度校正、化学位移的校正，在谱峰检测及谱峰匹配后过滤掉可能引起误差的峰，利用OPLS、wilcoxon秩和检验及HottelingsT2检验方法对数据进行统计分析，并结合化合物的化学位移，进行波峰指认。
[结果]
1.病理结果：
实验总过程为27周，其中，实验中后期实验组大鼠开始死亡9只，存活率为82％。对照组无死亡。肝脏病理证实对照组均为正常肝脏；实验组病理提示胆管细胞癌3例、不典型性增生6例、腺瘤样增生1例、肝细胞癌31例。其中肝细胞癌Ⅰ级14例，Ⅱ级4例，Ⅲ级7例，Ⅳ级6例。
2.HR-MAS MRS结果：
所得的有效波谱数为26例(正常对照组11例；肝脏肿瘤组15例，其中肝细胞癌10例，胆管细胞癌1例，腺瘤样增生1例，不典型性增生3例)。经波谱分析及波峰指认，可得出以下结果：
①正常对照组其胆碱、甘油磷酸胆碱、β-葡萄糖、α-葡萄糖、甘油三酯相对浓度分别为11.2±3.4、7.04±3.10、11.7±4.81、29.1±4.71，13.3±12.1，而DEN处理组其相对浓度为2.41±2.00、1.18±1.26、2.40±3.57、11.9±7.32，1.24±2.16，说明以上代谢物在正常肝脏组相对含量高于经DEN处理的肝脏肿瘤组(P＜0.05)。DEN处理组的谷氨酸、异亮氨酸、赖氨酸的相对浓度分别为4.57±2.28、6.34±3.40、5.83±3.88，均高于正常对照组的0.245±0.400、0.406±0.59、0.425±0.618(P＜0.05)。
②肝细胞癌与其他病理类型病变(胆管细胞癌、不典型性增生、腺瘤样增生)：肝细胞癌中胆碱的相对浓度为2.39±1.42，高于其他病理类型的0.242±0.387(P＜0.05)。其它差异较大的有赖氨酸，它在肝细胞癌中浓度相对较高，但P＞0.05，这可能是因为样本量比较少造成。
③由于肝细胞癌不同级别所含的样本量少，无法行统计检验。但在不同分级的肝细胞癌的代谢物分析中，可见糖原+葡萄糖相对浓度在肝细胞癌Ⅰ级中明显高于Ⅱ-Ⅳ级；丙氨酸在Ⅰ-Ⅲ级中基本上未检测到，而在Ⅳ级相对含量明显增高。
[结论]
1.本研究结果表明，通过DEN诱导成功制备了大鼠肝癌模型，为肝脏肿瘤的离体高分辨魔角旋转质子波谱分析提供了可靠的动物模型。
2.本研究采用离体高分辨魔角旋转核磁共振技术，避免组织萃取等复杂处理过程引入的误差因素，同时得到高分辨谱图，既提高了图谱谱峰指认的准确度，又降低了统计分析的误差。
3.以OPLS(正交信号校正偏最小二乘法)将肝癌和其它病理类型的肝组织代谢物及不同分级肝癌的代谢物差异很好的区分出来。与大鼠正常肝脏组织比较，经DEN处理肝脏肿瘤组织的谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、异亮氨酸(Ile)相对浓度升高(P＜0.05)；正常肝脏胆碱(Cho)、甘油磷酸胆碱(GPC)、葡萄糖+糖原(Glc+Gly)、α[-葡萄糖(α-Glc)、β-葡萄糖(β-Glc)及甘油三酯(TG)含量高于肿瘤组织(P＜0.05)；肝细胞癌较其他病理类型具有相对高的胆碱含量(P＜0.05)。低分化的肝癌与高分化肝癌也体现出代谢产物的差异趋势。