论文部分内容阅读
目的：研究发夹状小分子干扰RNA（small RNA interference，siRNA）联合磁性纳米四氧化三铁颗粒[magnetic nanoparticle of Fe3O4，MNP（Fe3O4）]逆转白血病多药耐药细胞株K562/AO2多药耐药的作用及其逆转耐药的效果，为临床白血病的治疗提供一定的理论依据。
方法:（1）分别以mdr-1 mRNA第3491-3509，1539-1557和3103-3121核苷酸作为靶点，合成针对靶区域序列的发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）克隆入pGCSilencer-U6-Ne0-GFP载体，重组质粒分别为PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3。应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和序列测定以证实重组质粒打靶序列的正确性。（2）因该载体同时表达GFP标记基因，荧光显微镜下观察在脂质体介导下转染K562/AO2细胞足否发绿色荧光，计算转染效率。（3）转染K562/AO2细胞株后筛选阳性表达载体，筛选出mdr-1基因抑制率最高的载体，然后与携载有柔红霉素（daunorubicinDNR）的MNP（Fe3O4）共培养48h。（4）采用实时定量逆转录聚合酶链反应（real time reversetranscript polymerase chain reaction，Real time RT-PCR）检测mdr-1基因mRNA转录情况。（5）蛋白免疫印迹法（western blot，WB）法观察P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达。（6）应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞内柔红霉素的浓度。
结果:（1）成功构建mdr-1基因siRNA表达载体，PCR电泳图谱和测序结果显示重组质粒的打靶序列完全正确。（2）荧光显微镜下K562/AO2细胞的转染效率为（19.9±1.2）％。（3）重组质粒PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3中，PGY1-2对mdr-1基因转录抑制率最高且P-gp的表达量最低。（4）Real time RT-PCR检测细胞mdr-1mRNA的转录情况：①K562细胞mdr-1 mRNA转录为阴性，K562/AO2细胞mdr-1mRNA转录为阳性。②单用PGY1-2或携载DNR的MNP（Fe3O4）均能下调K562/A02细胞的mdr-1mRNA转录，当PGY1-2和携载DNR的MNP（Fe3O4）联合作用于K562/A02细胞时，mdr-1mRNA转录明显降低，与二者单独应用时相比，差别有统计学意义（p<0.05）。（5）Western blot法检测P-gp表达结果显示：与K562细胞相比，K562/A02细胞的P-gp表达水平较高。与K562/A02细胞空白对照组相比，10μg/ml MNP（Fe3O4）或PGY1-2单独作用时，均可降低K562/A02细胞的P-gp水平，差别有统计学意义（p<0.05）。与单用1.0μg/ml DNR相比，10μg/mlMNP（Fe3O4）携载1.0μg/ml的DNR或经PGY1-2转染和1.0μg/mlDNR处理，K562/A02细胞的P-gP水平下调更明显，差别有统计学意义（p<0.05）。当转染了PGY1-2的K562/A02细胞与携载1.0μg/ml DNR的10μg/ml MNP（Fe3O4）共培养48h后，P-gp水平下调最明显，与单用1.0μg/ml DNR组，10μg/ml MNP（Fe3O4）+1.0μg/ml DNR组和PGY1-2+1.0μg/ml DNR组相比，差别具有统计学意义（p<0.05）。（6）流式结果显示：单用PGY1-2或携载DNR的MNP（Fe3O4）均能使K562/A02细胞内DNR浓度增加，当PGY1-2和携载DNR的MNP（Fe3O4）联合作用时K562/A02细胞内DNR浓度增加最明显，差别有统计学意义（p<0.05）。K562/A02分别经，空白对照组（K562/A02），DNR，DNR和MNP（Fe3O4），DNR和PGY1-2，DNR、MNP（Fe3O4）和PGY1-2，处理后细胞内药物浓度分别为：170±12，2490±19，3318±22，5513±20，6930±12。
结论:1.携载有DNR的磁性纳米Fe3O4颗粒可以下调K562/A02细胞mdr-1mRNA的转录和降低P-gp水平的表达。2.mdr-1基因siRNA表达载体转染K562/A02细胞时可以下调mdr-1mRNA的转录和降低P-gp水平的表达。3.mdr-1基因siRNA表达载体和携载有DNR的磁性纳米Fe3O4颗粒联合作用于K562/A02细胞时，与二者单独应用时相比，具有明显逆转耐药的作用。
方法:（1）分别以mdr-1 mRNA第3491-3509，1539-1557和3103-3121核苷酸作为靶点，合成针对靶区域序列的发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）克隆入pGCSilencer-U6-Ne0-GFP载体，重组质粒分别为PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3。应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和序列测定以证实重组质粒打靶序列的正确性。（2）因该载体同时表达GFP标记基因，荧光显微镜下观察在脂质体介导下转染K562/AO2细胞足否发绿色荧光，计算转染效率。（3）转染K562/AO2细胞株后筛选阳性表达载体，筛选出mdr-1基因抑制率最高的载体，然后与携载有柔红霉素（daunorubicinDNR）的MNP（Fe3O4）共培养48h。（4）采用实时定量逆转录聚合酶链反应（real time reversetranscript polymerase chain reaction，Real time RT-PCR）检测mdr-1基因mRNA转录情况。（5）蛋白免疫印迹法（western blot，WB）法观察P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达。（6）应用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞内柔红霉素的浓度。
结果:（1）成功构建mdr-1基因siRNA表达载体，PCR电泳图谱和测序结果显示重组质粒的打靶序列完全正确。（2）荧光显微镜下K562/AO2细胞的转染效率为（19.9±1.2）％。（3）重组质粒PGY1-1，PGY1-2和PGY1-3中，PGY1-2对mdr-1基因转录抑制率最高且P-gp的表达量最低。（4）Real time RT-PCR检测细胞mdr-1mRNA的转录情况：①K562细胞mdr-1 mRNA转录为阴性，K562/AO2细胞mdr-1mRNA转录为阳性。②单用PGY1-2或携载DNR的MNP（Fe3O4）均能下调K562/A02细胞的mdr-1mRNA转录，当PGY1-2和携载DNR的MNP（Fe3O4）联合作用于K562/A02细胞时，mdr-1mRNA转录明显降低，与二者单独应用时相比，差别有统计学意义（p<0.05）。（5）Western blot法检测P-gp表达结果显示：与K562细胞相比，K562/A02细胞的P-gp表达水平较高。与K562/A02细胞空白对照组相比，10μg/ml MNP（Fe3O4）或PGY1-2单独作用时，均可降低K562/A02细胞的P-gp水平，差别有统计学意义（p<0.05）。与单用1.0μg/ml DNR相比，10μg/mlMNP（Fe3O4）携载1.0μg/ml的DNR或经PGY1-2转染和1.0μg/mlDNR处理，K562/A02细胞的P-gP水平下调更明显，差别有统计学意义（p<0.05）。当转染了PGY1-2的K562/A02细胞与携载1.0μg/ml DNR的10μg/ml MNP（Fe3O4）共培养48h后，P-gp水平下调最明显，与单用1.0μg/ml DNR组，10μg/ml MNP（Fe3O4）+1.0μg/ml DNR组和PGY1-2+1.0μg/ml DNR组相比，差别具有统计学意义（p<0.05）。（6）流式结果显示：单用PGY1-2或携载DNR的MNP（Fe3O4）均能使K562/A02细胞内DNR浓度增加，当PGY1-2和携载DNR的MNP（Fe3O4）联合作用时K562/A02细胞内DNR浓度增加最明显，差别有统计学意义（p<0.05）。K562/A02分别经，空白对照组（K562/A02），DNR，DNR和MNP（Fe3O4），DNR和PGY1-2，DNR、MNP（Fe3O4）和PGY1-2，处理后细胞内药物浓度分别为：170±12，2490±19，3318±22，5513±20，6930±12。
结论:1.携载有DNR的磁性纳米Fe3O4颗粒可以下调K562/A02细胞mdr-1mRNA的转录和降低P-gp水平的表达。2.mdr-1基因siRNA表达载体转染K562/A02细胞时可以下调mdr-1mRNA的转录和降低P-gp水平的表达。3.mdr-1基因siRNA表达载体和携载有DNR的磁性纳米Fe3O4颗粒联合作用于K562/A02细胞时，与二者单独应用时相比，具有明显逆转耐药的作用。