论文部分内容阅读
背景：
心脑血管病是目前全球范围内疾病致死的主要原因之一，流行病学调查结果显示，中国是心血管疾病的高发国家，我国心血管疾病的发病率约为美国的3倍。目前，我国约有3亿人患有心脑血管疾病，而平均约每10秒便有1例患者因心血管疾病而死亡。冠心病是常见的一种心脑血管疾病，在过去的几十年中，其通常被认为是经济发达国家的高发疾病；但是随着社会的不断发展，目前我国的冠心病发病率明显增高，且可能超越发达国家。冠心病包括心肌梗死等5种类型，研究表明，我国心肌梗死的发病率较高，目前至少有250万人发生心脑血管疾病，且其发病率呈逐年增高趋势。随着医疗技术的不断进步，冠心病的临床治疗方式不断进步，介入和治疗药物治疗等技术均取得了长足进步，但全球急性冠脉综合征事件登记(Global Registry ofAcute Coronary Events，GRACE)数据显示，治疗6个月后，冠心病患者的总体结局却并未得到根本性的改变，其主要原因可能为急性心肌梗死的发病率、病死率以及致残率均较高。
心肌梗死属于一种炎症性疾病，主要由冠状动脉粥样硬化斑块的不断进展直至突然破裂，引发血栓快速形成、血管堵塞而导致的，是冠心病发展过程中最为危及生命的一个阶段。之前的研究认为，心肌梗死的主要根本原因为冠状动脉血管进行性狭窄。但近年来，大量相关研究表明，冠状动脉粥样硬化斑块的组织构成情况及稳定与否是心肌梗死发生、发展及预后的重要影响因素；因此，在某种程度上来讲，冠状动脉血管进行性狭窄的狭窄程度并不是决定心肌梗死的最关键因素。据既往统计数据综合看，超过68%的心肌梗死事件的发生均是由于易损斑块突发破裂而引发急性血栓形成导致的。在冠心病早期发展的过程中，多数患者一般无明显临床症状，主要是因为该阶段冠状动脉粥样硬化斑块的性质呈稳定状态；但是当冠状动脉粥样硬化斑块的组织构成情况及稳定性发生变化时，则极易导致破裂和继发性血栓的形成，因而将其称为易损斑块。易损斑块的主要病理学表现为血管平滑肌纤维帽较薄(＜65mm)、脂质核心较大，因而又称为薄纤维帽的纤维粥样斑块组织(thin-cap fibroatheroma，TCFA)。相关研究表明，易损斑块肩部积累了大量的巨噬-泡沫细胞及炎症因子；而血管平滑肌纤维帽变薄导致的粥样硬化斑块稳定性降低与巨噬-泡沫细胞的演化、凋亡、坏死及炎症因子释放、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)凋亡、细胞外基质降解过多密切相关。当动脉粥样硬化斑块纤维帽的完整性遭到破坏、甚至破裂时，斑块内的脂质将会暴露出来，进而激活循环系统内的血小板和纤溶系统，从而形成继发血栓，最终导致心肌梗死发生。
微小RNA-21(microRNA-21，miRNA-21)属于单链小分子RNA，重叠于蛋白质修饰基因VMP1。目前，临床针对miRNA-21的研究主要在肿瘤方面比较深入；相关研究表明，miRNA-21可能发挥着促癌基因的作用，因为其在多种恶性实体肿瘤组织中均呈现过表达。随着医学技术的不断发展，关于miRNA-21的临床研究不断深入，miRNA-21逐渐受到肿瘤学科之外其他学科医学工作者的重视，其在心血管系统中的表达情况也逐渐被人们了解和熟知。已有研究表明，miRNA-21在机体多个组织细胞中均呈高表达状态，其中包括血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、微循环内皮细胞以及心脏成纤维细胞。另外，还有研究表明，miRNA-21可以参与调控心血管疾病的发生、发展过程，并且miRNA-21的多个靶基因也被研究者先后发现和确定。目前，多数研究表明，miRNA-21在血管新生内膜损伤过程中发挥着十分重要的作用。通过对进行了血管成形术后的大鼠颈动脉斑块进行研究，结果发现miRNA-21表达水平异常降低能够在某种程度上抑制新生血管内膜的形成。除此之外还有一些研究者发现，miRNA-21的表达水平在发生动脉粥样硬化血管中呈明显上调现象。上述研究表明，miRNA-21在冠状动脉粥样硬化的发生发展等一系列过程中均扮演着重要的角色，但其中的具体机制目前尚不十分清除。在机体中，miRNA-21能够靶向抑制程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)的表达，从而对细胞增殖产生促进作用。还有一些报道表明，当上调细胞中miRNA-21的表达后能够抑制凋亡信号的传导；而当抑制细胞中miRNA-21的表达后，细胞凋亡数量显著增加。上述研究表明，miRNA-21可能参与调控了巨噬细胞的凋亡过程，而miRNA-21对细胞凋亡过程的调控可能是动脉粥样硬化斑块形成的一种潜在作用机制。
目的：
本课题将临床病例研究和细胞基础实验相结合，在单核-巨噬细胞的基础上对miRNA-21在动脉粥样硬化易损斑块中的作用进行研究，并对血浆和外周血中单核细胞miRNA-21的表达情况与动脉粥样硬化易损斑块的性质、冠状动脉的病变程度的关系进行分析。由于巨噬-泡沫细胞在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要作用，因此为了进一步研究miRNA-21在动脉粥样硬化发生、发展中的生物学作用，为临床治疗动脉粥样硬化提供新方向。本课题加深研究了miRNA-21对巨噬-泡沫细胞凋亡情况的影响及其作用机制，旨在为临床提供理论参考。
方法：
(1)选取2014年6月至2015年6月于郑州大学第一附属医院心血管内科住院治疗的患者80例，所有患者均行冠状动脉造影检查和冠脉血管成像CTA。根据临床症状不同将所有患者分为4组：急性心梗组(AMI，n=18)、不稳定性心绞痛组(UAP，n=21)、稳定性心绞痛组(SAP，n=17)、胸痛综合征组(CPS，n=24)。采集4组患者的清晨空腹外周血，并分离外周血中的单核细胞；采用荧光定量PCR技术对4组患者外周血中和单核细胞中miRNA-21的表达情况进行检测；并对miRNA-21与本研究入组冠心病患者临床特征的相关性进行分析。
(2)取对数生长期小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，根据随机数字表法将Raw264.7细胞分为4组：mimic-NC组，转染miRNA-21mimic阴性对照；miRNA-21mimic组，转染miRNA-21mimic；inhibitor-NC组，转染miRNA-21inhibitor阴性对照；miRNA-21inhibitor组，转染miRNA-21inhibitor，检测上述4组细胞中miRNA-21的表达水平。采用随机数字表法将处于对数生长期的Raw264.7细胞分为3组：NC组，不进行转染；miRNA-21mimic组，转染miRNA-21mimic；miRNA-21inhibitor组，转染miRNA-21inhibitor。采用CCK-8法检测3组Raw264.7细胞转染24h后的增殖活性；采用TUNEL实验和流式细胞术检测3组Raw264.7细胞转染24h后的凋亡情况。
(3)检索miRanda数据库和Targentscan数据库，筛选microRNA的靶基因，构建含有荧光素酶报告基因的PDCD4突变型和PDCD4野生型质粒载体；将质粒载体和miRNA-21mimic共转染Raw264.7细胞，检测转染48h后Raw264.7细胞中荧光素酶的表达水平。将处于对数生长期的Raw264.7细胞根据随机数字表法分为NC组、miR-28mimic组、miR-28inhibitor组，采用蛋白质印迹(western blot)法检测各组Raw264.7细胞中PDCD4蛋白的表达情况。
结果：
(1)CPS组、SAP组、UAP组和AMI组患者的年龄、性别、危险因素(除了高脂血症外)、药物治疗情况比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；UAP和AMI组患者的热敏C-反应蛋白的水平明显高于CPS组(P＜0.01)。荧光定量PCR法检测结果显示，SAP组、UAP组和AMI组患者外周血单核细胞中miRNA-155的表达水平明显低于CPS组，CPS发展至AMI的过程中，miRNA-21的表达水平逐渐降低；在血浆中，miRNA-21的表达情况与外周血单核细胞中的表达情况一致，但SAP组和CPS组患者的血浆miRNA-21表达水平比较，差异无统计学意义(P＜0.05)。由经验丰富的冠脉介入医师判读冠脉造影结果，冠状动脉造影检查的结果显示，当冠状动脉的直径或管腔面积的狭窄程度≥50%时，42例患者确诊为冠心病(CAD)，38例患者确诊为非冠心病(non-CAD)。CAD患者外周血单核细胞和血浆中miRNA-21的表达水平均明显低于non-CAD患者[(2.82±0.25)vs(1.04±0.13),(2.07±0.14vs.1.14±0.13),P＜0.01]。血浆中miRNA-21的含量与PBMCs中miRNA-21的含量呈正比(r=0.764，p＜0.001)，表明血浆中的miRNA-21可能来源于外周血单个核细胞。对外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平与冠脉病变严重程度的相关性进行分析，结果显示：Gensiniscores与外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平呈负相关(r=-0.663，p＜0.001)，提示外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平与冠脉病变的严重程度呈负相关。软斑块组冠心病患者的miRNA-21的表达水平低于纤维斑块组和钙化斑块组(P＜0.05)；但纤维斑块组和钙化斑块组冠心病患者的miRNA-21表达水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。对冠状动脉粥样硬化患者临床特征与外周血单核细胞中miRNA-21的相关性进行Pearson和Spearman相关性分析，结果显示：总胆固醇、HDL-C水平与动脉粥样硬化患者外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平呈正相关；年龄、高血压、HDL-C水平、吸烟、hs-CRP水平、ACEI、Statins与动脉粥样硬化患者外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平呈负相关。
(2)转染后，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞中miRNA-21的表达水平高于mimic-NC组，miRNA-21inhibitor组细胞中miRNA-21的表达水平低于inhibitor-NC组，差异均有统计学意义((t=4.315、3.396，P＜0.05)。表明，本研究成功构建了miRNA-21过表达和低表达Raw264.7细胞系。为了探究miRNA-21在Raw264.7细胞增殖过程中的作用，本研究采用CCK-8法对转染后Raw264.7细胞的增殖活性进行检测，结果显示：miRNA-21mimic组、miRNA-21inhibitor组Raw264.7细胞的增殖活性与NC组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。表明miRNA-21可能并未参调控Raw264.7细胞的增殖过程。本研究采用TUNEL法对转染后各组Raw264.7细胞的凋亡率进行检测，以探讨miRNA-21在Raw264.7细胞凋亡过程中的作用，结果发现，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞的凋亡细胞数量低于NC组(t=3.288，P=0.015)；miRNA-21inhibitor组Raw264.7细胞的凋亡细胞数量高于inhibitor-NC组(t=3.011，P=0.025)。表明miRNA-21对Raw264.7细胞的凋亡可能具有抑制作用。为了进一步从定量的角度研究miRNA-21对Raw264.7细胞凋亡的影响，本研究采用流式细胞术对转染后各组细胞的凋亡率进行检测，结果显示，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞的凋亡率低于NC组(t=3.179，P=0.013)；miRNA-21inhibitor组Raw264.7细胞的凋亡率高于inhibitor-NC组(t=3.283，P=0.011)。
(3)对miRNA-21的靶基因进行预测，结果显示，PDCD4为miRNA-21的一个靶基因，而miRNA-21在PDCD4上所绑定的位置位于其3’UTR区域。westernblot检测结果显示，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞中PDCD4蛋白的表达水平低于NC组(t=3.031，P=0.024)；miRNA-21inhibitor组PDCD4蛋白的表达量明显高于miRNA-21mimic组(t=3.211，P=0.022)。表明miRNA-21的表达与PDCD4蛋白的表达呈负相关。为了验证miRNA-21是否可以直接调控PDCD4的表达，本研究采用荧光素酶报告系统进行进一步验证，结果显示：miRNA-21mimic与PDCD43’UTRWT共转染组Raw264.7细胞中荧光素酶的表达量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；而miRNA-21mimic与PDCD43’UTRMut共转染组Raw264.7细胞中的荧光素酶的表达量与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。表明miRNA-21可能直接调控PDCD4的表达。
结论：
(1)miRNA-21的表达水平与复杂的致血管动脉粥样硬化的代谢危险因素、冠状动脉狭窄病变的严重程度、斑块稳定性呈负相关，提示miRNA-21在动脉粥样硬化的进展中起到了保护作用。
(2)miRNA-21通过作用于其靶基因PDCD4，抑制了小鼠单核巨噬细胞的凋亡，因此有望提供一种新的动脉粥样硬化的治疗方法。
心脑血管病是目前全球范围内疾病致死的主要原因之一，流行病学调查结果显示，中国是心血管疾病的高发国家，我国心血管疾病的发病率约为美国的3倍。目前，我国约有3亿人患有心脑血管疾病，而平均约每10秒便有1例患者因心血管疾病而死亡。冠心病是常见的一种心脑血管疾病，在过去的几十年中，其通常被认为是经济发达国家的高发疾病；但是随着社会的不断发展，目前我国的冠心病发病率明显增高，且可能超越发达国家。冠心病包括心肌梗死等5种类型，研究表明，我国心肌梗死的发病率较高，目前至少有250万人发生心脑血管疾病，且其发病率呈逐年增高趋势。随着医疗技术的不断进步，冠心病的临床治疗方式不断进步，介入和治疗药物治疗等技术均取得了长足进步，但全球急性冠脉综合征事件登记(Global Registry ofAcute Coronary Events，GRACE)数据显示，治疗6个月后，冠心病患者的总体结局却并未得到根本性的改变，其主要原因可能为急性心肌梗死的发病率、病死率以及致残率均较高。
心肌梗死属于一种炎症性疾病，主要由冠状动脉粥样硬化斑块的不断进展直至突然破裂，引发血栓快速形成、血管堵塞而导致的，是冠心病发展过程中最为危及生命的一个阶段。之前的研究认为，心肌梗死的主要根本原因为冠状动脉血管进行性狭窄。但近年来，大量相关研究表明，冠状动脉粥样硬化斑块的组织构成情况及稳定与否是心肌梗死发生、发展及预后的重要影响因素；因此，在某种程度上来讲，冠状动脉血管进行性狭窄的狭窄程度并不是决定心肌梗死的最关键因素。据既往统计数据综合看，超过68%的心肌梗死事件的发生均是由于易损斑块突发破裂而引发急性血栓形成导致的。在冠心病早期发展的过程中，多数患者一般无明显临床症状，主要是因为该阶段冠状动脉粥样硬化斑块的性质呈稳定状态；但是当冠状动脉粥样硬化斑块的组织构成情况及稳定性发生变化时，则极易导致破裂和继发性血栓的形成，因而将其称为易损斑块。易损斑块的主要病理学表现为血管平滑肌纤维帽较薄(＜65mm)、脂质核心较大，因而又称为薄纤维帽的纤维粥样斑块组织(thin-cap fibroatheroma，TCFA)。相关研究表明，易损斑块肩部积累了大量的巨噬-泡沫细胞及炎症因子；而血管平滑肌纤维帽变薄导致的粥样硬化斑块稳定性降低与巨噬-泡沫细胞的演化、凋亡、坏死及炎症因子释放、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)凋亡、细胞外基质降解过多密切相关。当动脉粥样硬化斑块纤维帽的完整性遭到破坏、甚至破裂时，斑块内的脂质将会暴露出来，进而激活循环系统内的血小板和纤溶系统，从而形成继发血栓，最终导致心肌梗死发生。
微小RNA-21(microRNA-21，miRNA-21)属于单链小分子RNA，重叠于蛋白质修饰基因VMP1。目前，临床针对miRNA-21的研究主要在肿瘤方面比较深入；相关研究表明，miRNA-21可能发挥着促癌基因的作用，因为其在多种恶性实体肿瘤组织中均呈现过表达。随着医学技术的不断发展，关于miRNA-21的临床研究不断深入，miRNA-21逐渐受到肿瘤学科之外其他学科医学工作者的重视，其在心血管系统中的表达情况也逐渐被人们了解和熟知。已有研究表明，miRNA-21在机体多个组织细胞中均呈高表达状态，其中包括血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、微循环内皮细胞以及心脏成纤维细胞。另外，还有研究表明，miRNA-21可以参与调控心血管疾病的发生、发展过程，并且miRNA-21的多个靶基因也被研究者先后发现和确定。目前，多数研究表明，miRNA-21在血管新生内膜损伤过程中发挥着十分重要的作用。通过对进行了血管成形术后的大鼠颈动脉斑块进行研究，结果发现miRNA-21表达水平异常降低能够在某种程度上抑制新生血管内膜的形成。除此之外还有一些研究者发现，miRNA-21的表达水平在发生动脉粥样硬化血管中呈明显上调现象。上述研究表明，miRNA-21在冠状动脉粥样硬化的发生发展等一系列过程中均扮演着重要的角色，但其中的具体机制目前尚不十分清除。在机体中，miRNA-21能够靶向抑制程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)的表达，从而对细胞增殖产生促进作用。还有一些报道表明，当上调细胞中miRNA-21的表达后能够抑制凋亡信号的传导；而当抑制细胞中miRNA-21的表达后，细胞凋亡数量显著增加。上述研究表明，miRNA-21可能参与调控了巨噬细胞的凋亡过程，而miRNA-21对细胞凋亡过程的调控可能是动脉粥样硬化斑块形成的一种潜在作用机制。
目的：
本课题将临床病例研究和细胞基础实验相结合，在单核-巨噬细胞的基础上对miRNA-21在动脉粥样硬化易损斑块中的作用进行研究，并对血浆和外周血中单核细胞miRNA-21的表达情况与动脉粥样硬化易损斑块的性质、冠状动脉的病变程度的关系进行分析。由于巨噬-泡沫细胞在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要作用，因此为了进一步研究miRNA-21在动脉粥样硬化发生、发展中的生物学作用，为临床治疗动脉粥样硬化提供新方向。本课题加深研究了miRNA-21对巨噬-泡沫细胞凋亡情况的影响及其作用机制，旨在为临床提供理论参考。
方法：
(1)选取2014年6月至2015年6月于郑州大学第一附属医院心血管内科住院治疗的患者80例，所有患者均行冠状动脉造影检查和冠脉血管成像CTA。根据临床症状不同将所有患者分为4组：急性心梗组(AMI，n=18)、不稳定性心绞痛组(UAP，n=21)、稳定性心绞痛组(SAP，n=17)、胸痛综合征组(CPS，n=24)。采集4组患者的清晨空腹外周血，并分离外周血中的单核细胞；采用荧光定量PCR技术对4组患者外周血中和单核细胞中miRNA-21的表达情况进行检测；并对miRNA-21与本研究入组冠心病患者临床特征的相关性进行分析。
(2)取对数生长期小鼠单核巨噬细胞Raw264.7，根据随机数字表法将Raw264.7细胞分为4组：mimic-NC组，转染miRNA-21mimic阴性对照；miRNA-21mimic组，转染miRNA-21mimic；inhibitor-NC组，转染miRNA-21inhibitor阴性对照；miRNA-21inhibitor组，转染miRNA-21inhibitor，检测上述4组细胞中miRNA-21的表达水平。采用随机数字表法将处于对数生长期的Raw264.7细胞分为3组：NC组，不进行转染；miRNA-21mimic组，转染miRNA-21mimic；miRNA-21inhibitor组，转染miRNA-21inhibitor。采用CCK-8法检测3组Raw264.7细胞转染24h后的增殖活性；采用TUNEL实验和流式细胞术检测3组Raw264.7细胞转染24h后的凋亡情况。
(3)检索miRanda数据库和Targentscan数据库，筛选microRNA的靶基因，构建含有荧光素酶报告基因的PDCD4突变型和PDCD4野生型质粒载体；将质粒载体和miRNA-21mimic共转染Raw264.7细胞，检测转染48h后Raw264.7细胞中荧光素酶的表达水平。将处于对数生长期的Raw264.7细胞根据随机数字表法分为NC组、miR-28mimic组、miR-28inhibitor组，采用蛋白质印迹(western blot)法检测各组Raw264.7细胞中PDCD4蛋白的表达情况。
结果：
(1)CPS组、SAP组、UAP组和AMI组患者的年龄、性别、危险因素(除了高脂血症外)、药物治疗情况比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；UAP和AMI组患者的热敏C-反应蛋白的水平明显高于CPS组(P＜0.01)。荧光定量PCR法检测结果显示，SAP组、UAP组和AMI组患者外周血单核细胞中miRNA-155的表达水平明显低于CPS组，CPS发展至AMI的过程中，miRNA-21的表达水平逐渐降低；在血浆中，miRNA-21的表达情况与外周血单核细胞中的表达情况一致，但SAP组和CPS组患者的血浆miRNA-21表达水平比较，差异无统计学意义(P＜0.05)。由经验丰富的冠脉介入医师判读冠脉造影结果，冠状动脉造影检查的结果显示，当冠状动脉的直径或管腔面积的狭窄程度≥50%时，42例患者确诊为冠心病(CAD)，38例患者确诊为非冠心病(non-CAD)。CAD患者外周血单核细胞和血浆中miRNA-21的表达水平均明显低于non-CAD患者[(2.82±0.25)vs(1.04±0.13),(2.07±0.14vs.1.14±0.13),P＜0.01]。血浆中miRNA-21的含量与PBMCs中miRNA-21的含量呈正比(r=0.764，p＜0.001)，表明血浆中的miRNA-21可能来源于外周血单个核细胞。对外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平与冠脉病变严重程度的相关性进行分析，结果显示：Gensiniscores与外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平呈负相关(r=-0.663，p＜0.001)，提示外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平与冠脉病变的严重程度呈负相关。软斑块组冠心病患者的miRNA-21的表达水平低于纤维斑块组和钙化斑块组(P＜0.05)；但纤维斑块组和钙化斑块组冠心病患者的miRNA-21表达水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。对冠状动脉粥样硬化患者临床特征与外周血单核细胞中miRNA-21的相关性进行Pearson和Spearman相关性分析，结果显示：总胆固醇、HDL-C水平与动脉粥样硬化患者外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平呈正相关；年龄、高血压、HDL-C水平、吸烟、hs-CRP水平、ACEI、Statins与动脉粥样硬化患者外周血单核细胞中miRNA-21的表达水平呈负相关。
(2)转染后，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞中miRNA-21的表达水平高于mimic-NC组，miRNA-21inhibitor组细胞中miRNA-21的表达水平低于inhibitor-NC组，差异均有统计学意义((t=4.315、3.396，P＜0.05)。表明，本研究成功构建了miRNA-21过表达和低表达Raw264.7细胞系。为了探究miRNA-21在Raw264.7细胞增殖过程中的作用，本研究采用CCK-8法对转染后Raw264.7细胞的增殖活性进行检测，结果显示：miRNA-21mimic组、miRNA-21inhibitor组Raw264.7细胞的增殖活性与NC组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。表明miRNA-21可能并未参调控Raw264.7细胞的增殖过程。本研究采用TUNEL法对转染后各组Raw264.7细胞的凋亡率进行检测，以探讨miRNA-21在Raw264.7细胞凋亡过程中的作用，结果发现，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞的凋亡细胞数量低于NC组(t=3.288，P=0.015)；miRNA-21inhibitor组Raw264.7细胞的凋亡细胞数量高于inhibitor-NC组(t=3.011，P=0.025)。表明miRNA-21对Raw264.7细胞的凋亡可能具有抑制作用。为了进一步从定量的角度研究miRNA-21对Raw264.7细胞凋亡的影响，本研究采用流式细胞术对转染后各组细胞的凋亡率进行检测，结果显示，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞的凋亡率低于NC组(t=3.179，P=0.013)；miRNA-21inhibitor组Raw264.7细胞的凋亡率高于inhibitor-NC组(t=3.283，P=0.011)。
(3)对miRNA-21的靶基因进行预测，结果显示，PDCD4为miRNA-21的一个靶基因，而miRNA-21在PDCD4上所绑定的位置位于其3’UTR区域。westernblot检测结果显示，miRNA-21mimic组Raw264.7细胞中PDCD4蛋白的表达水平低于NC组(t=3.031，P=0.024)；miRNA-21inhibitor组PDCD4蛋白的表达量明显高于miRNA-21mimic组(t=3.211，P=0.022)。表明miRNA-21的表达与PDCD4蛋白的表达呈负相关。为了验证miRNA-21是否可以直接调控PDCD4的表达，本研究采用荧光素酶报告系统进行进一步验证，结果显示：miRNA-21mimic与PDCD43’UTRWT共转染组Raw264.7细胞中荧光素酶的表达量低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；而miRNA-21mimic与PDCD43’UTRMut共转染组Raw264.7细胞中的荧光素酶的表达量与对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。表明miRNA-21可能直接调控PDCD4的表达。
结论：
(1)miRNA-21的表达水平与复杂的致血管动脉粥样硬化的代谢危险因素、冠状动脉狭窄病变的严重程度、斑块稳定性呈负相关，提示miRNA-21在动脉粥样硬化的进展中起到了保护作用。
(2)miRNA-21通过作用于其靶基因PDCD4，抑制了小鼠单核巨噬细胞的凋亡，因此有望提供一种新的动脉粥样硬化的治疗方法。