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研究目的
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高发生率及高死亡率的原发性肝癌。在全球范围内，每年死于肝癌的患者数目超过80万，在各种恶性肿瘤中死亡率位居第一。目前，临床上除手术切除病灶、经导管肝动脉化疗栓塞术及肝移植等治疗手段外，索拉非尼和乐伐替尼是被FDA批准用于治疗晚期HCC的一线化学药物。临床仅不足30％的患者可以手术治疗，而索拉非尼对患者生存期的延长有限，总生存期仅延长2.3—2.7个月。另外，现有的手术、化疗或放疗的治疗方式对肝癌的转移和复发却难以产生有效的抑制作用。因此，探索肝癌的发生发展机制、寻找潜在的干预靶点或治疗手段极为重要。
有研究证实，在铂类、蒽环类等化学药物或放射治疗肿瘤时，肿瘤细胞可发生免疫原性死亡，即肿瘤细胞在发生凋亡的同时，由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞。免疫原性死亡的肿瘤细胞表面高表达钙网蛋白(Calretieulin， CRT)、内质网中蛋白二硫化异构酶(Endoplasmic reticulum resident protein 57，ERp57)、热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)、高迁移率族迁徙族蛋白B1(High mobility group protein B1，HMGB-1)等特征性的蛋白分子，这些分子能激发机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别与攻击。Calreticulin和ERp57等被作为“eatme”信号分子，促进肿瘤细胞对DC的粘附，激活DC的MHC-I抗原呈递信号通路，从而活化CD8+T细胞。肿瘤细胞膜上的糖蛋白CD47由于能抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，因而被认为是一种“donteatme”信号。死亡的肿瘤细胞释放的ATP可通过P2Y2嘌呤受体促进DC的募集被称作“findme”信号分子。细胞在发生免疫原性死亡早期，作为“eatme”信号的calreticulin和ERp57等在大量转移到细胞表面的同时，细胞膜上CD47的表达水平显著性下降，“donteatme”信号和“eatme”信号的此消彼长，使得肿瘤细胞能被DC和巨噬细胞有效识别和吞噬。因此，诱导免疫原性肿瘤细胞死亡是抗肿瘤治疗的目标之一，该作用可以通过激活机体免疫系统产生更强而有效的抗肿瘤效应。
信号传导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription， STAT)STAT3是STAT家族的重要成员，其在肿瘤组织中的异常持续激活，可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核转导，促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡，这与恶性肿瘤的发生发展密切相关。约60％的肝癌患者伴有STAT3高表达，并与不良预后呈正相关。我们之前的研究也证明，阻断STAT3可以通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制HCC的增殖;另外，阻断HCC中STAT3信号通路可以明显提高NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答;并且，阻断STAT3的HCC可以诱导抗肿瘤免疫记忆、改善肿瘤免疫微环境。然而，该过程是否与免疫原性死亡有关尚未进行深入的研究。
Napabucasin是一种口服的针对STAT3和癌细胞多能性的抑制剂，可下调STAT3驱动的干细胞基因表达和自我更新能力，并诱导细胞死亡。Li等在体内外证实，Napabucasin通过阻断STAT3信号抑制胰腺癌、咽鳞癌、结直肠癌等肿瘤干性特征，进一步影响肿瘤的复发和转移。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，Napabucasin针对胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种转移性实体瘤疗效显著，控制率均达到80％以上。然而，Napabucasin对肝癌的治疗是否有效尚未见报道。鉴于STAT3在肝癌发生发展中的重要作用，我们推测Napabucasin有望应用于肝癌的治疗。
因此，本研究利用携带STAT3-shRNA的慢病毒和新型小分子抑制剂Napabucasin阻断肝癌细胞中STAT3信号通路，在体内外模型中观察其是否可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡，并深入阐述其作用机制;进一步，系统评价了Napabucasin对肝癌干细胞特征的影响。该研究为肝细胞癌的治疗提供了有潜力的靶点，也为Napabucasin对肝癌治疗的临床应用提供良好的实验依据。
研究方法
1.利用携带STAT3-shRNA的慢病毒感染Huh7和HepG2.2.15肝癌细胞系，48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平，其中挽救实验使用携带STAT3-WT和STAT3-Y705F的慢病毒感染STAT3干扰组细胞;CCK-8和Annexin-V/PI标记分别检测细胞的增殖和凋亡;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90和CD47的表达变化;ELISA检测细胞培养上清中ATP的分泌水平。
2.从健康志愿者外周血中分离单个核细胞，诱导形成未成熟的hDC，与Huh7和HepG2.2.15细胞共孵育48h后，流式细胞术检测hDC细胞表面CD80和CD86的表达变化。
3.使用PMA诱导THP-1形成贴壁巨噬细胞，并进行CM-Dil染料进行标记，与CFSE标记的肝癌细胞共孵育2小时后，流式细胞术检测巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬情况。
4.利用westernbloting检测Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3/p-STAT3、PKR/p-PKR、eIF2α/p-eIF2α的表达水平;IP和GSTpull-down实验观察STAT3与PKR的结合作用。
5.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中STAT3与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析CD47的启动子序列，进一步应用ChIP实验鉴定STAT3是否直接与CD47的启动子序列结合。
6.不同浓度的2-DG处理Huh7和HepG2.2.15细胞0-72h，CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞表面calreticulin和CD47的表达变化。
7.应用SeahorseXF24细胞能量代谢分析仪检测Huh7和HepG2.2.15细胞的糖酵解水平。
8.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的表达水平及与病人生存期的相关性;分析肝癌患者癌组织中STAT3与HIF-1α、LDHA表达水平的相关性。
9.应用RT-qPCR技术检测Huh7和HepG2.2.15细胞中糖酵解相关分子HIF-1α、GLUT1、HK2和口LDHA的mRNA水平。
10.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中GLUT1与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析GLUT1的启动子序列，进一步应用ChIP实验观察STAT3是否直接与GLUT1的启动子序列结合。
11.以人肝癌细胞系Huh7、HepG2和HepG2.2.15，以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6为研究对象，CCK-8检测Napabucasin、Cryptotanshinone和Oxaliplatin处理上述肝癌细胞系48h后的细胞活力。
12.Napabucasin处理Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞12h后，westernbloting检测细胞中STAT3/p-STAT3Tyr705的水平;PI标记分析细胞周期;Annexin-V/PI标记检测细胞凋亡情况;Hoechst标记观察细胞核固缩情况;RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;细胞集落形成实验和细胞成球实验分别检测细胞集落形成抑制率和细胞成球率。
13.Napabucasin处理Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞球后，RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;JuLITMStage实时检测细胞球形态;CCK-8检测细胞球活力。
14.应用RT-qPCR技术检测HepG2.2.15细胞中HBx、HBc和HBs/p的mRNA水平。
15.Napabucasin处理Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞后，SeahorseXF24细胞能量代谢分析仪检测细胞糖酵解水平;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达变化;与DC共孵育48h后，流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、CD40和MHCⅡ的表达变化。
16.利用携带STAT3-shRNA的质粒转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞，48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平;流式细胞术检测细胞表面caketiculin、ERp57、HSP70、HSP90和CD47的表达变化。
17.从C57BL/6J小鼠骨髓中分离骨髓细胞，诱导培养形成未成熟的mDC，与Hepa1-6细胞共孵育48h后，流式细胞术检测mDC细胞表面CD80、CD86、CD40和MHCⅡ的表达变化。
18.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J肝脏原位移植瘤小鼠模型，于2周后腹腔注射20mg/kg的Napabucasin，每2天一次，连续治疗8次;分离小鼠肝脏的肝细胞，流式细胞术检测CD95和PD-L1表达水平;分离小鼠肝脏中浸润的淋巴细胞，流式细胞术分析巨噬细胞、DC和CD8+T细胞的浸润量及活化水平。
19.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J皮下移植瘤小鼠模型，第5天开始给予药物治疗，每2天给予小鼠腹腔注射20mg/kg的Napabucasin，连续8次。随后，将小鼠分为两组，一组小鼠剥离其皮下肿瘤，并于1周后在另一侧皮下注射Hepa1-6细胞观察肿瘤复发情况，另一组小鼠用于生存期观察。
20.对剥离的小鼠皮下移植瘤组织进行免疫荧光组织化学检测，分析calreticulin、ERp57、CD47和GLUT1的表达水平;分离皮下移植瘤中的肿瘤细胞，流式细胞术检测Ki67、CD95和PD-L1表达水平;RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平。
21.分离小鼠皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞，流式细胞术分析巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的浸润量及活化情况;流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞的浸润量及免疫抑制功能状态。
22.对Hepa1-6细胞构建的皮下移植瘤小鼠模型，第12天皮下形成明显肿瘤块时给予腹腔注射Napabucasin治疗，每2天一次，连续治疗8次。随后，剥离小鼠皮下移植瘤组织分别进行HE和Tunel染色分析肿瘤病理和细胞凋亡情况;分离皮下移植瘤中肿瘤细胞，RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平;分离皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞，流式细胞术分析CD8+T和NK细胞的浸润量及活化情况。
研究结果
1.靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡
干扰人肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞中STAT3信号通路可以显著性抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，同时促进calreticulm、ERp57、HSP70和HSP90等“eatme”信号分子的膜转移，促进ATP向细胞外的释放。另外，干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可以促进其对DC的活化作用，增加DC表面CD80和CD86的表达。
我们观察到“donteatme”信号分子CD47在肝癌患者肿瘤组织中高表达，并与STAT3的表达水平呈正相关;CHIP实验证实，STAT3可通过与CD47的启动子区域结合直接调控CD47的转录与表达。因此，干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可降低CD47在细胞表面的表达，促进巨噬细胞对其的吞噬。
2.STAT3通过与PKR形成复合物调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化
STAT3通过与eIF2α的上游调节分子PKR结合形成STAT3-PKR复合物，从而调节游离的PKR及其磷酸化水平，进一步调控eIF2α的磷酸化水平。干扰STAT3在Huh7和HepG2.2.15细胞的表达，可以减少STAT3-PKR复合物的形成，使游离的PKR及pPKR增多，从而促进免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化。
3.STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制HCC免疫原性死亡
与正常组织相比，肝癌患者肿瘤组织中糖酵解关键酶HIF-1α、GLUT1、HK2表达水平明显升高，且癌组织中高表达GLUT1、HK2和LDHA的肝癌患者往往伴随着生存期缩短。另外，肝癌患者的癌组织中STAT3与HIF-1α和LDHA的表达水平呈正相关。干扰Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3信号通路，显著性降低糖酵解相关的关键分子HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的mRNA水平，伴随肝癌细胞的糖酵解水平和最大糖酵解能力均明显降低。
糖酵解阻断剂2-DG可抑制Huh7和HepG2.2.15细胞的增殖，并诱导肝癌细胞免疫原性死亡。TCGA数据库显示，肝癌患者的癌组织中GLUT1与CD47的表达水平呈正相关。GLUT1抑制剂STF-31可以显著性增加calreticulin在HepG2.2.15细胞表面的表达，而降低CD47的表达水平。进一步通过CHIP实验证实，STAT3可通过与GLUT1的启动子区域结合直接调控GLUT1的转录与表达。
4.STAT3抑制剂Napabucasin体内外诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境
Napabucasin可显著性增加Huh7和HepG2.2.15以及Hepa1-6细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达量，促进肝癌细胞对DC的活化作用。在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠模型中，Napabucasin治疗组小鼠肿瘤的生长速度低于溶剂对照组，并且肿瘤细胞表面calreticulin和ERp57的表达水平明显升高，而CD47和GLUT1的水平显著性降低;肿瘤浸润的CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+DC细胞明显增加且活化水平提高，同时肿瘤浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量明显增加，并且具有免疫抑制功能的LAG-3、PD1和KLRG1在CD8+T细胞上的表达较对照组均明显减少。进一步，在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠Rechallenge实验中，Napabucasin治疗组中有75％的小鼠能抵抗第二次接种的Hepa1-6细胞的生长，而溶剂对照组小鼠100％出现肿瘤复发的情况。
虽然，Napabucasin在对晚期给予Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠治疗中没有表现出明显的抑制作用，但是可以促进NK细胞的肿瘤浸润，并具有免疫抑制功能的LAG-3、Tim-3在CD8+T细胞和NK细胞上的表达降低，而IFNγ的表达水平的提高。
5.STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答
在Hepa1-6细胞肝脏原位移植瘤小鼠中，Napabucasin治疗可以明显缩小肝脏癌变组织的大小，并伴随CD95+肝细胞数的增加和PD-L1+肝细胞数的减少。同时，Napabucasin治疗组小鼠肝脏中巨噬细胞的浸润数量及表达共刺激分子CD86的表达水平都明显高于溶剂对照组。另外，两组小鼠肝脏中浸润的DC数量虽然明显差异，但Napabucasin治疗组小鼠肝脏中浸润的DC表达的CD80和MHCⅡ的水平较溶剂对照组明显增加。更为重要的是，Napabucasin治疗组小鼠肝脏中CD8+T细胞数量明显增多，并且免疫抑制受体PD-1和LAG-3在CD8+T细胞上的表达降低。
6.STAT3抑制剂Napabucasin显著抑制肝癌细胞的千性特征
体外实验发现Napabucasin抑制Huh7、SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15和Hepa1-6等肝癌细胞的活力作用强于Cryptotanshinone和Oxaliplatin，其IC50值明显低于另外两种药物。同时，Napabucasin可以抑制Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞的集落形成以及成球数，并可以裂解肝癌细胞球体。进一步分析发现，Napabucasin可以抑制Huh7和Hepa1-6细胞及细胞球体中Nanog、Sox-2和OCT4等肿瘤干性相关分子的mRNA水平。
7.STAT3抑制剂Napabucasin可抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤生长
早期给予Napabucasin治疗可明显抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存期。Napabucasin治疗组小鼠肿瘤组织中Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平明显降低，并伴随CD95+肿瘤细胞数的增加和Ki67+、PD-L1+肿瘤细胞数的减少。晚期给予Napabucasin治疗，可以增加肿瘤组织中细胞凋亡数目及坏死区域，与早期治疗结果一致，Napabucasin可以抑制肿瘤组织中干性相关分子的表达。
结论
在本研究证明干扰STAT3信号通路可诱导肝癌细胞免疫原性死亡，表现为作为“eatme”信号的calreticulin和ERp57等大量转移到细胞表面，而细胞膜上“donteatme”信号分子CD47的表达水平显著性下降，且STAT3可以直接靶向CD47启动子;同时，细胞培养上清中作为“findme”信号的ATP释放增加，促使肝癌细胞被DC和巨噬细胞对肿瘤细胞的有效识别和吞噬。另外，干扰STAT3信号通路可降低肝癌细胞糖酵解关键酶水平，降低糖酵解水平，促进肿瘤细胞免疫原性死亡，并且STAT3可直接调控GLUT1的转录。进一步，利用小鼠皮下移植瘤和肝脏原位移植瘤模型证明，STAT3抑制剂Napabucasin处理可以增加肿瘤组织中DC和巨噬细胞的浸润数量及抗原呈递功能，促进CD4+T和CD8+T细胞在肿瘤组织的募集，减少KLRG1+及免疫抑制受体LAG-3+、PD1+的CD8+T细胞数，并产生抗肿瘤的免疫记忆作用。另外，Napabucasin在抑制Hepa1-6细胞的生长的同时，还可以抑制肿瘤干细胞的形成，延长小鼠生存期。
意义
该研究证明，靶向STAT3信号通路可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡，改善肿瘤免疫微环境，逆转肿瘤的免疫耐受状态，在机体产生抗肿瘤免疫记忆中发挥着极为重要的作用，为STAT3作为肝癌治疗靶点及Napabucasin的临床应用提供了充分的理论依据和详实的实验依据，也为下一步建立新的肝癌治疗策略提供新思路。
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种高发生率及高死亡率的原发性肝癌。在全球范围内，每年死于肝癌的患者数目超过80万，在各种恶性肿瘤中死亡率位居第一。目前，临床上除手术切除病灶、经导管肝动脉化疗栓塞术及肝移植等治疗手段外，索拉非尼和乐伐替尼是被FDA批准用于治疗晚期HCC的一线化学药物。临床仅不足30％的患者可以手术治疗，而索拉非尼对患者生存期的延长有限，总生存期仅延长2.3—2.7个月。另外，现有的手术、化疗或放疗的治疗方式对肝癌的转移和复发却难以产生有效的抑制作用。因此，探索肝癌的发生发展机制、寻找潜在的干预靶点或治疗手段极为重要。
有研究证实，在铂类、蒽环类等化学药物或放射治疗肿瘤时，肿瘤细胞可发生免疫原性死亡，即肿瘤细胞在发生凋亡的同时，由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞。免疫原性死亡的肿瘤细胞表面高表达钙网蛋白(Calretieulin， CRT)、内质网中蛋白二硫化异构酶(Endoplasmic reticulum resident protein 57，ERp57)、热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)、高迁移率族迁徙族蛋白B1(High mobility group protein B1，HMGB-1)等特征性的蛋白分子，这些分子能激发机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别与攻击。Calreticulin和ERp57等被作为“eatme”信号分子，促进肿瘤细胞对DC的粘附，激活DC的MHC-I抗原呈递信号通路，从而活化CD8+T细胞。肿瘤细胞膜上的糖蛋白CD47由于能抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，因而被认为是一种“donteatme”信号。死亡的肿瘤细胞释放的ATP可通过P2Y2嘌呤受体促进DC的募集被称作“findme”信号分子。细胞在发生免疫原性死亡早期，作为“eatme”信号的calreticulin和ERp57等在大量转移到细胞表面的同时，细胞膜上CD47的表达水平显著性下降，“donteatme”信号和“eatme”信号的此消彼长，使得肿瘤细胞能被DC和巨噬细胞有效识别和吞噬。因此，诱导免疫原性肿瘤细胞死亡是抗肿瘤治疗的目标之一，该作用可以通过激活机体免疫系统产生更强而有效的抗肿瘤效应。
信号传导及转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription， STAT)STAT3是STAT家族的重要成员，其在肿瘤组织中的异常持续激活，可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核转导，促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡，这与恶性肿瘤的发生发展密切相关。约60％的肝癌患者伴有STAT3高表达，并与不良预后呈正相关。我们之前的研究也证明，阻断STAT3可以通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制HCC的增殖;另外，阻断HCC中STAT3信号通路可以明显提高NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答;并且，阻断STAT3的HCC可以诱导抗肿瘤免疫记忆、改善肿瘤免疫微环境。然而，该过程是否与免疫原性死亡有关尚未进行深入的研究。
Napabucasin是一种口服的针对STAT3和癌细胞多能性的抑制剂，可下调STAT3驱动的干细胞基因表达和自我更新能力，并诱导细胞死亡。Li等在体内外证实，Napabucasin通过阻断STAT3信号抑制胰腺癌、咽鳞癌、结直肠癌等肿瘤干性特征，进一步影响肿瘤的复发和转移。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，Napabucasin针对胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种转移性实体瘤疗效显著，控制率均达到80％以上。然而，Napabucasin对肝癌的治疗是否有效尚未见报道。鉴于STAT3在肝癌发生发展中的重要作用，我们推测Napabucasin有望应用于肝癌的治疗。
因此，本研究利用携带STAT3-shRNA的慢病毒和新型小分子抑制剂Napabucasin阻断肝癌细胞中STAT3信号通路，在体内外模型中观察其是否可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡，并深入阐述其作用机制;进一步，系统评价了Napabucasin对肝癌干细胞特征的影响。该研究为肝细胞癌的治疗提供了有潜力的靶点，也为Napabucasin对肝癌治疗的临床应用提供良好的实验依据。
研究方法
1.利用携带STAT3-shRNA的慢病毒感染Huh7和HepG2.2.15肝癌细胞系，48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平，其中挽救实验使用携带STAT3-WT和STAT3-Y705F的慢病毒感染STAT3干扰组细胞;CCK-8和Annexin-V/PI标记分别检测细胞的增殖和凋亡;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90和CD47的表达变化;ELISA检测细胞培养上清中ATP的分泌水平。
2.从健康志愿者外周血中分离单个核细胞，诱导形成未成熟的hDC，与Huh7和HepG2.2.15细胞共孵育48h后，流式细胞术检测hDC细胞表面CD80和CD86的表达变化。
3.使用PMA诱导THP-1形成贴壁巨噬细胞，并进行CM-Dil染料进行标记，与CFSE标记的肝癌细胞共孵育2小时后，流式细胞术检测巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬情况。
4.利用westernbloting检测Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3/p-STAT3、PKR/p-PKR、eIF2α/p-eIF2α的表达水平;IP和GSTpull-down实验观察STAT3与PKR的结合作用。
5.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中STAT3与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析CD47的启动子序列，进一步应用ChIP实验鉴定STAT3是否直接与CD47的启动子序列结合。
6.不同浓度的2-DG处理Huh7和HepG2.2.15细胞0-72h，CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞表面calreticulin和CD47的表达变化。
7.应用SeahorseXF24细胞能量代谢分析仪检测Huh7和HepG2.2.15细胞的糖酵解水平。
8.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的表达水平及与病人生存期的相关性;分析肝癌患者癌组织中STAT3与HIF-1α、LDHA表达水平的相关性。
9.应用RT-qPCR技术检测Huh7和HepG2.2.15细胞中糖酵解相关分子HIF-1α、GLUT1、HK2和口LDHA的mRNA水平。
10.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中GLUT1与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析GLUT1的启动子序列，进一步应用ChIP实验观察STAT3是否直接与GLUT1的启动子序列结合。
11.以人肝癌细胞系Huh7、HepG2和HepG2.2.15，以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6为研究对象，CCK-8检测Napabucasin、Cryptotanshinone和Oxaliplatin处理上述肝癌细胞系48h后的细胞活力。
12.Napabucasin处理Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞12h后，westernbloting检测细胞中STAT3/p-STAT3Tyr705的水平;PI标记分析细胞周期;Annexin-V/PI标记检测细胞凋亡情况;Hoechst标记观察细胞核固缩情况;RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;细胞集落形成实验和细胞成球实验分别检测细胞集落形成抑制率和细胞成球率。
13.Napabucasin处理Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞球后，RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;JuLITMStage实时检测细胞球形态;CCK-8检测细胞球活力。
14.应用RT-qPCR技术检测HepG2.2.15细胞中HBx、HBc和HBs/p的mRNA水平。
15.Napabucasin处理Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞后，SeahorseXF24细胞能量代谢分析仪检测细胞糖酵解水平;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达变化;与DC共孵育48h后，流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、CD40和MHCⅡ的表达变化。
16.利用携带STAT3-shRNA的质粒转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞，48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平;流式细胞术检测细胞表面caketiculin、ERp57、HSP70、HSP90和CD47的表达变化。
17.从C57BL/6J小鼠骨髓中分离骨髓细胞，诱导培养形成未成熟的mDC，与Hepa1-6细胞共孵育48h后，流式细胞术检测mDC细胞表面CD80、CD86、CD40和MHCⅡ的表达变化。
18.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J肝脏原位移植瘤小鼠模型，于2周后腹腔注射20mg/kg的Napabucasin，每2天一次，连续治疗8次;分离小鼠肝脏的肝细胞，流式细胞术检测CD95和PD-L1表达水平;分离小鼠肝脏中浸润的淋巴细胞，流式细胞术分析巨噬细胞、DC和CD8+T细胞的浸润量及活化水平。
19.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J皮下移植瘤小鼠模型，第5天开始给予药物治疗，每2天给予小鼠腹腔注射20mg/kg的Napabucasin，连续8次。随后，将小鼠分为两组，一组小鼠剥离其皮下肿瘤，并于1周后在另一侧皮下注射Hepa1-6细胞观察肿瘤复发情况，另一组小鼠用于生存期观察。
20.对剥离的小鼠皮下移植瘤组织进行免疫荧光组织化学检测，分析calreticulin、ERp57、CD47和GLUT1的表达水平;分离皮下移植瘤中的肿瘤细胞，流式细胞术检测Ki67、CD95和PD-L1表达水平;RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平。
21.分离小鼠皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞，流式细胞术分析巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的浸润量及活化情况;流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞的浸润量及免疫抑制功能状态。
22.对Hepa1-6细胞构建的皮下移植瘤小鼠模型，第12天皮下形成明显肿瘤块时给予腹腔注射Napabucasin治疗，每2天一次，连续治疗8次。随后，剥离小鼠皮下移植瘤组织分别进行HE和Tunel染色分析肿瘤病理和细胞凋亡情况;分离皮下移植瘤中肿瘤细胞，RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平;分离皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞，流式细胞术分析CD8+T和NK细胞的浸润量及活化情况。
研究结果
1.靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡
干扰人肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞中STAT3信号通路可以显著性抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，同时促进calreticulm、ERp57、HSP70和HSP90等“eatme”信号分子的膜转移，促进ATP向细胞外的释放。另外，干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可以促进其对DC的活化作用，增加DC表面CD80和CD86的表达。
我们观察到“donteatme”信号分子CD47在肝癌患者肿瘤组织中高表达，并与STAT3的表达水平呈正相关;CHIP实验证实，STAT3可通过与CD47的启动子区域结合直接调控CD47的转录与表达。因此，干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可降低CD47在细胞表面的表达，促进巨噬细胞对其的吞噬。
2.STAT3通过与PKR形成复合物调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化
STAT3通过与eIF2α的上游调节分子PKR结合形成STAT3-PKR复合物，从而调节游离的PKR及其磷酸化水平，进一步调控eIF2α的磷酸化水平。干扰STAT3在Huh7和HepG2.2.15细胞的表达，可以减少STAT3-PKR复合物的形成，使游离的PKR及pPKR增多，从而促进免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化。
3.STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制HCC免疫原性死亡
与正常组织相比，肝癌患者肿瘤组织中糖酵解关键酶HIF-1α、GLUT1、HK2表达水平明显升高，且癌组织中高表达GLUT1、HK2和LDHA的肝癌患者往往伴随着生存期缩短。另外，肝癌患者的癌组织中STAT3与HIF-1α和LDHA的表达水平呈正相关。干扰Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3信号通路，显著性降低糖酵解相关的关键分子HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的mRNA水平，伴随肝癌细胞的糖酵解水平和最大糖酵解能力均明显降低。
糖酵解阻断剂2-DG可抑制Huh7和HepG2.2.15细胞的增殖，并诱导肝癌细胞免疫原性死亡。TCGA数据库显示，肝癌患者的癌组织中GLUT1与CD47的表达水平呈正相关。GLUT1抑制剂STF-31可以显著性增加calreticulin在HepG2.2.15细胞表面的表达，而降低CD47的表达水平。进一步通过CHIP实验证实，STAT3可通过与GLUT1的启动子区域结合直接调控GLUT1的转录与表达。
4.STAT3抑制剂Napabucasin体内外诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境
Napabucasin可显著性增加Huh7和HepG2.2.15以及Hepa1-6细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达量，促进肝癌细胞对DC的活化作用。在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠模型中，Napabucasin治疗组小鼠肿瘤的生长速度低于溶剂对照组，并且肿瘤细胞表面calreticulin和ERp57的表达水平明显升高，而CD47和GLUT1的水平显著性降低;肿瘤浸润的CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+DC细胞明显增加且活化水平提高，同时肿瘤浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量明显增加，并且具有免疫抑制功能的LAG-3、PD1和KLRG1在CD8+T细胞上的表达较对照组均明显减少。进一步，在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠Rechallenge实验中，Napabucasin治疗组中有75％的小鼠能抵抗第二次接种的Hepa1-6细胞的生长，而溶剂对照组小鼠100％出现肿瘤复发的情况。
虽然，Napabucasin在对晚期给予Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠治疗中没有表现出明显的抑制作用，但是可以促进NK细胞的肿瘤浸润，并具有免疫抑制功能的LAG-3、Tim-3在CD8+T细胞和NK细胞上的表达降低，而IFNγ的表达水平的提高。
5.STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答
在Hepa1-6细胞肝脏原位移植瘤小鼠中，Napabucasin治疗可以明显缩小肝脏癌变组织的大小，并伴随CD95+肝细胞数的增加和PD-L1+肝细胞数的减少。同时，Napabucasin治疗组小鼠肝脏中巨噬细胞的浸润数量及表达共刺激分子CD86的表达水平都明显高于溶剂对照组。另外，两组小鼠肝脏中浸润的DC数量虽然明显差异，但Napabucasin治疗组小鼠肝脏中浸润的DC表达的CD80和MHCⅡ的水平较溶剂对照组明显增加。更为重要的是，Napabucasin治疗组小鼠肝脏中CD8+T细胞数量明显增多，并且免疫抑制受体PD-1和LAG-3在CD8+T细胞上的表达降低。
6.STAT3抑制剂Napabucasin显著抑制肝癌细胞的千性特征
体外实验发现Napabucasin抑制Huh7、SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15和Hepa1-6等肝癌细胞的活力作用强于Cryptotanshinone和Oxaliplatin，其IC50值明显低于另外两种药物。同时，Napabucasin可以抑制Huh7、HepG2.2.15和Hepa1-6细胞的集落形成以及成球数，并可以裂解肝癌细胞球体。进一步分析发现，Napabucasin可以抑制Huh7和Hepa1-6细胞及细胞球体中Nanog、Sox-2和OCT4等肿瘤干性相关分子的mRNA水平。
7.STAT3抑制剂Napabucasin可抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤生长
早期给予Napabucasin治疗可明显抑制肿瘤的生长，延长小鼠生存期。Napabucasin治疗组小鼠肿瘤组织中Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平明显降低，并伴随CD95+肿瘤细胞数的增加和Ki67+、PD-L1+肿瘤细胞数的减少。晚期给予Napabucasin治疗，可以增加肿瘤组织中细胞凋亡数目及坏死区域，与早期治疗结果一致，Napabucasin可以抑制肿瘤组织中干性相关分子的表达。
结论
在本研究证明干扰STAT3信号通路可诱导肝癌细胞免疫原性死亡，表现为作为“eatme”信号的calreticulin和ERp57等大量转移到细胞表面，而细胞膜上“donteatme”信号分子CD47的表达水平显著性下降，且STAT3可以直接靶向CD47启动子;同时，细胞培养上清中作为“findme”信号的ATP释放增加，促使肝癌细胞被DC和巨噬细胞对肿瘤细胞的有效识别和吞噬。另外，干扰STAT3信号通路可降低肝癌细胞糖酵解关键酶水平，降低糖酵解水平，促进肿瘤细胞免疫原性死亡，并且STAT3可直接调控GLUT1的转录。进一步，利用小鼠皮下移植瘤和肝脏原位移植瘤模型证明，STAT3抑制剂Napabucasin处理可以增加肿瘤组织中DC和巨噬细胞的浸润数量及抗原呈递功能，促进CD4+T和CD8+T细胞在肿瘤组织的募集，减少KLRG1+及免疫抑制受体LAG-3+、PD1+的CD8+T细胞数，并产生抗肿瘤的免疫记忆作用。另外，Napabucasin在抑制Hepa1-6细胞的生长的同时，还可以抑制肿瘤干细胞的形成，延长小鼠生存期。
意义
该研究证明，靶向STAT3信号通路可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡，改善肿瘤免疫微环境，逆转肿瘤的免疫耐受状态，在机体产生抗肿瘤免疫记忆中发挥着极为重要的作用，为STAT3作为肝癌治疗靶点及Napabucasin的临床应用提供了充分的理论依据和详实的实验依据，也为下一步建立新的肝癌治疗策略提供新思路。