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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居各类肿瘤中的第三位，五年生存率低于18％,严重威胁人民生命健康水平。因此，提高HCC患者预后、延长患者生存期至关重要。手术治疗是HCC患者的主要治疗方法。然而，HCC早期诊断困难，大多数患者在被确诊时已经发展为HCC晚期或发生转移，只有20～30％患者适合手术治疗。此外，由于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTC)的存在，HCC转移复发率较高，预后效果仍然十分有限。CTC是HCC转移的关键标志物，已成为HCC转移治疗的关键靶点之一。早期诊断困难、治疗效果有限及治疗后的转移复发是HCC患者预后差的关键原因。因此，探索新的有效策略提高早期诊断特异性、提高治疗效果、增强转移抑制是HCC治疗的研究热点，对提高HCC预后至关重要。全方位考虑影响HCC预后的多种因素是HCC诊疗研究的先进思路，多模式联合新型HCC诊疗理念是提高HCC预后的必要手段。
纳米药物递送系统(Nano-based drug delivery system，NDDS)为多模式联合新型HCC诊疗理念提供了良好的解决策略。目前，多种基于NDDS的纳米药物制剂已获批应用于临床，如Doxil(R)，Lipusu(R)，Abraxane(R)，Genexol-PM(R)等，显著提高了肿瘤治疗效率，利用NDDS实现提高患者预后己成为抗肿瘤的有效手段。其中，脂质体因具有载药量高、易于靶向修饰、生物相容性好、制备工艺简单、易于工业转化等优势，是临床转化使用最多的纳米载体。目前已有14种脂质体药物获批进入临床。因此，本论文选择脂质体作为多模式联合新型HCC诊疗理念的递送载体，进行实验方案的设计。
将诊断剂或治疗剂特异性递送至靶细胞或靶部位是提高HCC早期诊断、联合治疗及转移抑制效果至关重要的策略。基于NDDS的特异性靶向递送策略为提高HCC早期诊断、联合治疗和转移抑制提供了更好的解决思路。迫切需要选择一种在肿瘤中特异性分布、在肿瘤早期即高表达、在正常组织细胞不表达的新靶点，以提高HCC诊断特异性和治疗准确性。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种在HCC早期即高表达的癌胎蛋白聚糖，在70～100％的HCC病例中高度表达，而在正常组织细胞不表达。GPC3作为一种HCC特异性靶向受体，被作为HCC诊断标志物或诊断治疗新靶点广泛研究。因此，基于GPC3的特异性靶向策略对提高HCC早期诊断、精准治疗和转移抑制效果具有极大潜力，临床应用前景广阔。
综上，为提高HCC早期诊断特异性、增强治疗效果和抑制转移，本论文全方位考虑影响HCC预后的多种因素，首次提出多模式联合新型HCC诊疗理念，选择生物利用度好、易于临床转化的脂质体作为药物递送载体，选择HCC高表达的GPC3作为特异性靶向受体，设计制备两种多功能GPC3特异性靶向脂质体，以期提高HCC早期诊断特异性和联合治疗效果，有效抑制HCC转移。针对HCC早期诊断困难和治疗效果有限的问题，构建GPC3特异性靶向共载化疗药物索拉非尼(Sorafenib，SF)和光热剂IR780碘化物多功能脂质体(GSI-Lip)，提高HCC早期诊断及化学-光热联合治疗效果;针对以CTC为靶点抑制转移的研究存在靶向捕获困难和CTC多样性问题，创新性提出多点共打击策略同时消除原发肿瘤细胞和CTC的治疗方案。构建GPC3和血管细胞黏附分子1(Vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)特异性靶向共载SF和洋地黄毒苷(Digitoxin，DT)多功能脂质体(GV-Lipo/SF/DT)，不仅实现消除原发肿瘤，还能特异性靶向识别捕获CTC、解离CTC细胞簇、阻止CTC-中性粒细胞簇形成，从而抑制HCC转移，提高治疗效果。本课题主要研究内容及结果如下:
第一部分GPC3特异性靶向共载SF和IR780多功能脂质体用于HCC早期诊断和化学-光热联合治疗的研究
第一章GPC3特异性靶向肽选择及靶向功能材料的合成与表征。GPC3在HepG2和H22细胞高表达，在HL-7702和肝实质细胞低表达。因此，课题选择HepG2和H22细胞分别作为人源和鼠源GPC3阳性细胞系，选择HL-7702和正常小鼠肝实质细胞分别作为人源和鼠源GPC3阴性细胞系。采用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)和流式细胞仪(Flow cytometer，FCM)分析三种GPC3靶向肽对实验细胞的相对结合能力优选GPC3靶向肽，结果表明G12靶向肽具有更高GPC3靶向性和特异性，因此，选择G12靶向肽进行后续研究。成功合成靶向功能材料DSPE-PEG2000-G12，为后续靶向纳米制剂的制备做准备。
第二章SF和IR780含量测定方法的建立。本文用高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)法和紫外吸收分光光度计(Ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-Vis)分别测定SF和IR780的浓度，建立了相应的含量测定方法。两种检测方法的专属性、灵敏度和回收率均符合要求，满足实验需要。
第三章GPC3特异性靶向共载SF和IR780多功能脂质体的制备及初步评价。采用单因素考察法进行制剂处方优化，根据载药量和包封率结果，最终优选磷脂浓度20mg/mL，药脂比(w/w)1∶15，磷脂和胆固醇之比(w/w)8∶1，水化温度60℃，水化时间30min为制剂优化处方和工艺。制备GPC3靶向SF和IR780共载脂质体GSI-Lip，其形态圆整，粒径为140.9±3.70nm，多分散指数(Polydispersion index，PDI)为0.191±0.008，电位为-19.03±0.30mV。稳定性实验结果表明，GSI-Lip具有良好的血浆稳定性和储存稳定性。体外释放实验结果表明SF能够从脂质体中有效释放，光热能够促进SF的释放，这可能有利于增强化学-光热联合治疗的协同效果。细胞摄取实验、竞争性抑制实验、入胞途径考察及近红外小动物活体成像结果表明，GPC3靶向脂质体具有优异的体内外靶向能力。
第四章GPC3特异性靶向载IR780多功能脂质体早期诊断能力考察。构建荷H22细胞KM小鼠模型，以IR780为近红外诊断试剂，近红外小动物活体成像结果表明，GPC3靶向脂质体(GI-Lip)比叶酸(Folic acid，FA)受体靶向脂质体(FI-Lip)具有更高的HCC诊断特异性(p＜0.01)。设计不同荷瘤细胞数、荷瘤后不同生长时间的荷H22细胞KM小鼠模型，考察GPC3靶向脂质体的早期诊断能力，结果表明，GPC3靶向脂质体最小能够检测到5×105细胞荷瘤第2天肿瘤(3.45±0.98mm3)，FA受体靶向脂质体最小可检测到1×105细胞荷瘤第4天肿瘤(32.90±10.01mm3)，GPC3靶向脂质体诊断敏感性提高8.54倍。与FA受体靶向脂质体相比，GPC3靶向脂质体具有更高的诊断敏感性和特异性，可以实现HCC早期诊断。
第五章GPC3特异性靶向共载SF和IR780多功能脂质体抗肿瘤效果评价。MTT实验结果表明，GSI-Lip比SF和IR780共载脂质体(SI-Lip)具有更高的体外细胞毒性。抑瘤实验结果表明，GSI-Lip抗肿瘤效果优于FA受体靶向共载SF和IR780脂质体(FSI-Lip,p＜0.01)，抑瘤率为90.52％。化学-光热联合治疗抗肿瘤实验结果显示，与不使用激光的GSI-Lip相比，GSI-Lip加激光组具有更优异的抗肿瘤活性(p＜0.01)，肿瘤抑制率为94.93％。溶血实验和组织切片结果表明，GSI-Lip的生物相容性良好，没有明显的系统毒性。
第二部分多点共打击SF和DT共载多功能脂质体消除原发肿瘤细胞和associated-CTC增强HCC转移抑制及治疗效果的研究
第六章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体的制备及初步评价。成功制备GV-Lipo/SF/DT，其形态圆整，平均粒径为148.77±5.88nm，PDI为0.221±0.019，电位为-11.20±0.46mV。GV-Lipo/SF/DT中SF载药量为(4.38±0.14)％，包封率为(89.25±9.62)％;DT载药量为(0.28±0.04)％，包封率为(97.58±1.60)％。稳定性实验结果表明，GV-Lipo/SF/DT具有良好的储存稳定性和血浆稳定性。体外释放实验结果表明SF和DT能够从GV-Lipo/SF/DT中有效释放。细胞摄取实验、竞争性抑制实验和近红外小动物活体成像结果表明，GPC3和VCAM1双靶向脂质体较GPC3或VCAM1单靶向脂质体具有更好的体内外靶向能力。采用HPLC波长全扫描建立了SF和DT的含量测定方法，检测方法的专属性、灵敏度和回收率均符合要求。
第七章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体抑制associated-CTC能力评价。体外采用锥板粘度计模拟血液流动，动态细胞摄取实验结果表明GV-Lipo/SF/DT具有良好体外识别和捕获流动状态下Hepa1-6细胞能力。CTC细胞簇小鼠转移模型结果表明与GFPHepa1-6-luc单细胞相比，GFPHepa1-6-luc细胞簇会增加HCC肺转移，而DT孵育后可以解离GFPHepa1-6-luc细胞簇，使肺转移减少。细胞内Ca2+浓度测定实验结果表明DT可能是通过增加细胞内Ca2+浓度解离CTC簇。小鼠中性粒细胞与GFPHepa1-6-luc细胞共孵育实验结果表明，VCAM1单抗具有抑制CTC-中性粒细胞簇形成的能力。以GFPHepa1-6-luc细胞为CTC模型，建立体内CTC小鼠模型，通过流式细胞仪考察GV-Lipo/SF/DT体内消除CTC能力，结果表明GV-Lipo/SF/DT能在体内更特异性地识别和捕获CTC，从而有效消除CTC。
第八章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体抗肿瘤效果评价。体外MTT实验结果表明，GV-Lipo/SF/DT较Lipo/SF/DT具有良好的细胞毒性作用。细胞周期实验结果表明，SF和DT具有一定周期联合抑制效果，将细胞周期阻滞于G1期。Hepa1-63D肿瘤球深层渗透实验结果表明，实验浓度下DT对原发肿瘤细胞具有一定解离效果，可以增加制剂的肿瘤深层渗透能力，能在一定程度上增加GV-Lipo/SF/DT的抗肿瘤效果。GV-Lipo/SF/DT在荷H22细胞移植肿瘤模型和荷GFPHepa1-6-luc细胞原位肿瘤模型中均具有最优体内抗肿瘤效果，移植模型抑瘤率为90.28％。溶血实验、体内药效实验过程中小鼠体重变化及体内药效实验后主要组织器官H&E染色结果表明，GV-Lipo/SF/DT初步安全性良好。
第九章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体抑制复发及转移能力评价。建立荷H22小鼠术后复发模型，考察GV-Lipo/SF/DT抑制术后复发效果，结果表明GV-Lipo/SF/DT能有效抑制HCC术后复发。通过静脉注射H22细胞考察GV-Lipo/SF/DT对小鼠肝癌转移模型的抑制作用，结果表明DT和VCAM1单抗可以在一定程度上抑制转移，GV-Lipo/SF/DT能够有效抑制肝癌肺转移，转移抑制率为95.42％。
综上，本论文设计制备的两种多功能GPC3特异性靶向脂质体，提高了HCC早期诊断特异性和联合治疗效果，有效抑制HCC转移。第一部分设计制备的GSI-Lip促进了HCC早期诊断和联合治疗效果。GPC3靶向制剂较FA受体靶向制剂具有HCC早期诊断优势，GI-Lip最小可以诊断3.45±0.98mm3肿瘤。GSI-Lip+Laser具有最好的体内抗肿瘤效果。该研究为以GPC3为靶点的肿瘤治疗研究提供研究基础和理论依据。第二部分设计制备的GV-Lipo/SF/DT增强了HCC治疗效果，有效防止HCC肺转移。GV-Lipo/SF/DT靶向性增强，可在体内识别、捕获和有效消除CTC，解离CTC细胞簇，阻止CTC-中性粒细胞簇形成，从而有效防止转移。GV-Lipo/SF/DT对移植瘤模型和原位肝癌模型均有较好抗肿瘤作用。多点共同打击策略为肿瘤转移的全方位抑制开辟了新的可能性，为临床其他各种肿瘤提供新治疗理念。
纳米药物递送系统(Nano-based drug delivery system，NDDS)为多模式联合新型HCC诊疗理念提供了良好的解决策略。目前，多种基于NDDS的纳米药物制剂已获批应用于临床，如Doxil(R)，Lipusu(R)，Abraxane(R)，Genexol-PM(R)等，显著提高了肿瘤治疗效率，利用NDDS实现提高患者预后己成为抗肿瘤的有效手段。其中，脂质体因具有载药量高、易于靶向修饰、生物相容性好、制备工艺简单、易于工业转化等优势，是临床转化使用最多的纳米载体。目前已有14种脂质体药物获批进入临床。因此，本论文选择脂质体作为多模式联合新型HCC诊疗理念的递送载体，进行实验方案的设计。
将诊断剂或治疗剂特异性递送至靶细胞或靶部位是提高HCC早期诊断、联合治疗及转移抑制效果至关重要的策略。基于NDDS的特异性靶向递送策略为提高HCC早期诊断、联合治疗和转移抑制提供了更好的解决思路。迫切需要选择一种在肿瘤中特异性分布、在肿瘤早期即高表达、在正常组织细胞不表达的新靶点，以提高HCC诊断特异性和治疗准确性。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3，GPC3)是一种在HCC早期即高表达的癌胎蛋白聚糖，在70～100％的HCC病例中高度表达，而在正常组织细胞不表达。GPC3作为一种HCC特异性靶向受体，被作为HCC诊断标志物或诊断治疗新靶点广泛研究。因此，基于GPC3的特异性靶向策略对提高HCC早期诊断、精准治疗和转移抑制效果具有极大潜力，临床应用前景广阔。
综上，为提高HCC早期诊断特异性、增强治疗效果和抑制转移，本论文全方位考虑影响HCC预后的多种因素，首次提出多模式联合新型HCC诊疗理念，选择生物利用度好、易于临床转化的脂质体作为药物递送载体，选择HCC高表达的GPC3作为特异性靶向受体，设计制备两种多功能GPC3特异性靶向脂质体，以期提高HCC早期诊断特异性和联合治疗效果，有效抑制HCC转移。针对HCC早期诊断困难和治疗效果有限的问题，构建GPC3特异性靶向共载化疗药物索拉非尼(Sorafenib，SF)和光热剂IR780碘化物多功能脂质体(GSI-Lip)，提高HCC早期诊断及化学-光热联合治疗效果;针对以CTC为靶点抑制转移的研究存在靶向捕获困难和CTC多样性问题，创新性提出多点共打击策略同时消除原发肿瘤细胞和CTC的治疗方案。构建GPC3和血管细胞黏附分子1(Vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1)特异性靶向共载SF和洋地黄毒苷(Digitoxin，DT)多功能脂质体(GV-Lipo/SF/DT)，不仅实现消除原发肿瘤，还能特异性靶向识别捕获CTC、解离CTC细胞簇、阻止CTC-中性粒细胞簇形成，从而抑制HCC转移，提高治疗效果。本课题主要研究内容及结果如下:
第一部分GPC3特异性靶向共载SF和IR780多功能脂质体用于HCC早期诊断和化学-光热联合治疗的研究
第一章GPC3特异性靶向肽选择及靶向功能材料的合成与表征。GPC3在HepG2和H22细胞高表达，在HL-7702和肝实质细胞低表达。因此，课题选择HepG2和H22细胞分别作为人源和鼠源GPC3阳性细胞系，选择HL-7702和正常小鼠肝实质细胞分别作为人源和鼠源GPC3阴性细胞系。采用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope，CLSM)和流式细胞仪(Flow cytometer，FCM)分析三种GPC3靶向肽对实验细胞的相对结合能力优选GPC3靶向肽，结果表明G12靶向肽具有更高GPC3靶向性和特异性，因此，选择G12靶向肽进行后续研究。成功合成靶向功能材料DSPE-PEG2000-G12，为后续靶向纳米制剂的制备做准备。
第二章SF和IR780含量测定方法的建立。本文用高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)法和紫外吸收分光光度计(Ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-Vis)分别测定SF和IR780的浓度，建立了相应的含量测定方法。两种检测方法的专属性、灵敏度和回收率均符合要求，满足实验需要。
第三章GPC3特异性靶向共载SF和IR780多功能脂质体的制备及初步评价。采用单因素考察法进行制剂处方优化，根据载药量和包封率结果，最终优选磷脂浓度20mg/mL，药脂比(w/w)1∶15，磷脂和胆固醇之比(w/w)8∶1，水化温度60℃，水化时间30min为制剂优化处方和工艺。制备GPC3靶向SF和IR780共载脂质体GSI-Lip，其形态圆整，粒径为140.9±3.70nm，多分散指数(Polydispersion index，PDI)为0.191±0.008，电位为-19.03±0.30mV。稳定性实验结果表明，GSI-Lip具有良好的血浆稳定性和储存稳定性。体外释放实验结果表明SF能够从脂质体中有效释放，光热能够促进SF的释放，这可能有利于增强化学-光热联合治疗的协同效果。细胞摄取实验、竞争性抑制实验、入胞途径考察及近红外小动物活体成像结果表明，GPC3靶向脂质体具有优异的体内外靶向能力。
第四章GPC3特异性靶向载IR780多功能脂质体早期诊断能力考察。构建荷H22细胞KM小鼠模型，以IR780为近红外诊断试剂，近红外小动物活体成像结果表明，GPC3靶向脂质体(GI-Lip)比叶酸(Folic acid，FA)受体靶向脂质体(FI-Lip)具有更高的HCC诊断特异性(p＜0.01)。设计不同荷瘤细胞数、荷瘤后不同生长时间的荷H22细胞KM小鼠模型，考察GPC3靶向脂质体的早期诊断能力，结果表明，GPC3靶向脂质体最小能够检测到5×105细胞荷瘤第2天肿瘤(3.45±0.98mm3)，FA受体靶向脂质体最小可检测到1×105细胞荷瘤第4天肿瘤(32.90±10.01mm3)，GPC3靶向脂质体诊断敏感性提高8.54倍。与FA受体靶向脂质体相比，GPC3靶向脂质体具有更高的诊断敏感性和特异性，可以实现HCC早期诊断。
第五章GPC3特异性靶向共载SF和IR780多功能脂质体抗肿瘤效果评价。MTT实验结果表明，GSI-Lip比SF和IR780共载脂质体(SI-Lip)具有更高的体外细胞毒性。抑瘤实验结果表明，GSI-Lip抗肿瘤效果优于FA受体靶向共载SF和IR780脂质体(FSI-Lip,p＜0.01)，抑瘤率为90.52％。化学-光热联合治疗抗肿瘤实验结果显示，与不使用激光的GSI-Lip相比，GSI-Lip加激光组具有更优异的抗肿瘤活性(p＜0.01)，肿瘤抑制率为94.93％。溶血实验和组织切片结果表明，GSI-Lip的生物相容性良好，没有明显的系统毒性。
第二部分多点共打击SF和DT共载多功能脂质体消除原发肿瘤细胞和associated-CTC增强HCC转移抑制及治疗效果的研究
第六章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体的制备及初步评价。成功制备GV-Lipo/SF/DT，其形态圆整，平均粒径为148.77±5.88nm，PDI为0.221±0.019，电位为-11.20±0.46mV。GV-Lipo/SF/DT中SF载药量为(4.38±0.14)％，包封率为(89.25±9.62)％;DT载药量为(0.28±0.04)％，包封率为(97.58±1.60)％。稳定性实验结果表明，GV-Lipo/SF/DT具有良好的储存稳定性和血浆稳定性。体外释放实验结果表明SF和DT能够从GV-Lipo/SF/DT中有效释放。细胞摄取实验、竞争性抑制实验和近红外小动物活体成像结果表明，GPC3和VCAM1双靶向脂质体较GPC3或VCAM1单靶向脂质体具有更好的体内外靶向能力。采用HPLC波长全扫描建立了SF和DT的含量测定方法，检测方法的专属性、灵敏度和回收率均符合要求。
第七章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体抑制associated-CTC能力评价。体外采用锥板粘度计模拟血液流动，动态细胞摄取实验结果表明GV-Lipo/SF/DT具有良好体外识别和捕获流动状态下Hepa1-6细胞能力。CTC细胞簇小鼠转移模型结果表明与GFPHepa1-6-luc单细胞相比，GFPHepa1-6-luc细胞簇会增加HCC肺转移，而DT孵育后可以解离GFPHepa1-6-luc细胞簇，使肺转移减少。细胞内Ca2+浓度测定实验结果表明DT可能是通过增加细胞内Ca2+浓度解离CTC簇。小鼠中性粒细胞与GFPHepa1-6-luc细胞共孵育实验结果表明，VCAM1单抗具有抑制CTC-中性粒细胞簇形成的能力。以GFPHepa1-6-luc细胞为CTC模型，建立体内CTC小鼠模型，通过流式细胞仪考察GV-Lipo/SF/DT体内消除CTC能力，结果表明GV-Lipo/SF/DT能在体内更特异性地识别和捕获CTC，从而有效消除CTC。
第八章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体抗肿瘤效果评价。体外MTT实验结果表明，GV-Lipo/SF/DT较Lipo/SF/DT具有良好的细胞毒性作用。细胞周期实验结果表明，SF和DT具有一定周期联合抑制效果，将细胞周期阻滞于G1期。Hepa1-63D肿瘤球深层渗透实验结果表明，实验浓度下DT对原发肿瘤细胞具有一定解离效果，可以增加制剂的肿瘤深层渗透能力，能在一定程度上增加GV-Lipo/SF/DT的抗肿瘤效果。GV-Lipo/SF/DT在荷H22细胞移植肿瘤模型和荷GFPHepa1-6-luc细胞原位肿瘤模型中均具有最优体内抗肿瘤效果，移植模型抑瘤率为90.28％。溶血实验、体内药效实验过程中小鼠体重变化及体内药效实验后主要组织器官H&E染色结果表明，GV-Lipo/SF/DT初步安全性良好。
第九章多点共打击SF和DT共载多功能脂质体抑制复发及转移能力评价。建立荷H22小鼠术后复发模型，考察GV-Lipo/SF/DT抑制术后复发效果，结果表明GV-Lipo/SF/DT能有效抑制HCC术后复发。通过静脉注射H22细胞考察GV-Lipo/SF/DT对小鼠肝癌转移模型的抑制作用，结果表明DT和VCAM1单抗可以在一定程度上抑制转移，GV-Lipo/SF/DT能够有效抑制肝癌肺转移，转移抑制率为95.42％。
综上，本论文设计制备的两种多功能GPC3特异性靶向脂质体，提高了HCC早期诊断特异性和联合治疗效果，有效抑制HCC转移。第一部分设计制备的GSI-Lip促进了HCC早期诊断和联合治疗效果。GPC3靶向制剂较FA受体靶向制剂具有HCC早期诊断优势，GI-Lip最小可以诊断3.45±0.98mm3肿瘤。GSI-Lip+Laser具有最好的体内抗肿瘤效果。该研究为以GPC3为靶点的肿瘤治疗研究提供研究基础和理论依据。第二部分设计制备的GV-Lipo/SF/DT增强了HCC治疗效果，有效防止HCC肺转移。GV-Lipo/SF/DT靶向性增强，可在体内识别、捕获和有效消除CTC，解离CTC细胞簇，阻止CTC-中性粒细胞簇形成，从而有效防止转移。GV-Lipo/SF/DT对移植瘤模型和原位肝癌模型均有较好抗肿瘤作用。多点共同打击策略为肿瘤转移的全方位抑制开辟了新的可能性，为临床其他各种肿瘤提供新治疗理念。